Witaj ponownie!
Mail Grupowy pomaga Twojej grupie sprawnie się komunikować, dzielić notatkami, wydarzeniami i opiniami. Dowiedz się więcej »
Przedmioty Wykładowcy Uczelnie

Mikrobiologia


Uniwersytet Politechnika Wrocławska
Politechnika Wrocławska. Zamiejscowy Ośrodek Dydaktyczny w Jeleniej Górze
Politechnika Wrocławska. Zamiejscowy Ośrodek Dydaktyczny w Legnicy
Politechnika Wrocławska. Zamiejscowy Ośrodek Dydaktyczny w Wałbrzychu
PWr
Prowadzący Waldemar Adamiak
Informacja dla prowadzących
Podgląd

mikro 003.jpg

Plik dostępny po zalogowaniu.

mikro 002.jpg

Plik dostępny po zalogowaniu.

mikro 001.jpg

Plik dostępny po zalogowaniu.

mikrobiologia cz.2.doc

Podgląd pliku (pełna wersja wyższej jakości po zalogowaniu):

MIKROBIOLOGIA-ZAGADNIENIA cz. II

  1. Porównaj komórkę prokariotyczną i eukariotyczną. (ad. cz. I-13).



  1. Opisz cykl rozwojowy u Giardia i Cryptosporidium.

Giardia Pasożyt ten jest chorobotwórczym wiciowcem należącym do rodziny Hexamitidae. Giardia intestinalis wywołuje u człowieka chorobę jelit o nazwie lamblioza (syn. giardioza) [giardiosis]. Giardia intestinalis należy do pasożytów kosmopolitycznych, to znaczy, że zarażenia tym pierwotniakiem obserwuje się na terenie całej kuli ziemskiej. Ocenia się, że w Polsce zarażonych lamblią jest od kilku do kilkunastu procent osób dorosłych. Szczególnie narażone na tego wiciowca są dzieci.
Prewalencja (częstość zarażenia) giardia intestinalis w niektórych skupiskach dziecięcych takich jak żłobki, przedszkola, domy dziecka może czasami dochodzić nawet do 100%.

Lamblia pasożytuje w organizmie człowieka w postaci 2 form, to jest cystytrofozoitu. Trofozoit o charakterystycznym gruszkowatym kształcie jest dwubocznie symetryczny; na biegunie przednim jest zaokrąglony, natomiast w części tylnej jest zaostrzony. Na terenie cytoplazmy trofozoitu widoczne są 2 owalne jądra z chromatyną w środku oraz charakterystyczne dla lamblii kariomastigonty, aksonemy oraz ciała parabazalne. Lamblia ma również 4 pary wici: środkową, grzbietową, boczną i tylną. Na biegunie przednim trofozoitu znajduje się tak zwany krążek czepny, który umożliwia lamblii przyczepianie się do kosmków jelitowych błony śluzowej przewodu pokarmowego. W krążku czepnym znajdują się swoiste dla lamblii białka, tak zwane giardiny (α-giardina o masie cząsteczkowej 29 kDa oraz β-giardina o masie cząsteczkowej 33,8 kDa), które warunkują jego czynności fizjologiczne. Budowę trofozoitu lamblii przedstawiono na rycinie 1-6.
Cysta Giardia intestinalis jest owalna; zawiera charakterystyczną dla lamblii odstającą cytoplazmę od błony komórkowej. Na terenie cytoplazmy widoczne są 2 lub 4 jądra, aksonemy, twory sierpowate, zawiązki wici oraz liczne, bardzo drobne wodniczki jodofilne. Budowę cysty lamblii przedstawiono na rycinie 7-13.

Cysta po dostaniu się do organizmu człowieka ulega przekształceniu w procesie ekscystacjiw 2 trofozoity. Opisany proces zachodzi w dwunastnicy, gdzie trofozoity ulegają następnie dalszym podziałom, prowadząc do powstania licznej populacji trofozoitów, zdolnych do dalszej inwazji jelita cienkiego, dróg żółciowych i przewodów trzustki. W dalszych odcinkach przewodu pokarmowego trofozoity ulegają przekształceniu w procesie encystacji w cysty, które są następnie wydalane z kałem.

Do zarażenia lamblią jelitową dochodzi najczęściej drogą pokarmową przez połknięcie cyst pierwotniaka wraz z zarażoną nimi wodą lub żywnością. Możliwe jest także zarażenie lamblią poprzez stosunek seksualny, niemniej jednak do zarażenia tą drogą dochodzi niezwykle rzadko.

Giardia intestinalis wywołuje u człowieka tak zwaną lambliozę [gardiosis]. Lamblioza w pierwszym stadium chorobowym charakteryzuje się występowaniem nudności, wymiotów oraz bezkrwawej biegunki. W postaci przewlekłej tej choroby obserwuje się naprzemienne biegunki i zaparcia, bóle w nadbrzuszu, bóle głowy, stany podgorączkowe; występować mogą też objawy dyspeptyczne (wzdęcia, odbijania). Chory w tym czasie może się skarżyć na brak łaknienia oraz łatwe męczenie się. Utrzymujące się zarażenie giardia intestinalis może prowadzić do stopniowego zmniejszania się masy ciała wraz z zanikiem mięśniowym. U dzieci mogą występować choroby alergiczne, na przykład atopowe zapalenie skóry. Zauważono również, że 50% zarażeń giardia intestinalis przebiega z zaburzeniami trawienia tłuszczów, węglowodanów oraz awitaminozą A i B12; może również występować niedokrwistość niedobarwliwa, leukocytoza i eozynofilia.
Wykazano, że najbardziej podatne na zarażenie pasożytem giardia intestinalis są dzieci z niedoborami immunoglobulin klasy G i A.

Cryptosporidium parvum jest chorobotwórczym pierwotniakiem należącym do rodziny Cryptosporididae (podtyp Coccidia). Prowadzi pasożytniczy tryb życia w jelicie cienkim oraz układzie oddechowym człowieka i innych zwierząt (drób, bydło, psy, koty). Cryptosporidium parvum wywołuje u człowieka kryptosporidiozę [cryptosporidiosis] – chorobę o charakterze ostrego lub przewlekłego gastroenteritis.
Pasożyt ten z punktu widzenia medycznego ma duże znaczenie w pediatrii - atakuje szczególnie niemowlęta oraz dzieci, u których układ odpornościowy jest niedostatecznie rozwinięty i/lub wykazuje pewne dysfunkcje.
Cryptosporidium parvum jest ponadto wymieniane jako jeden z czynników tzw. biegunek podróżnych.

Podobnie jak u innych pierwotniaków należących do podtypu Coccidia (np. Isospora belli, Sarcocystis hominis, Toxoplasma gondii) cykl rozwojowy Cryptosporidium parvum jest złożony.
Wyróżnia się w nim etapy rozmnażania bezpłciowego (schizogonia) oraz etapy rozmnażania płciowego (sporogonia) – oba zachodzą na terenie organizmu żywiciela. Natomiast pewna część cyklu rozwojowego (tzn. nabywanie inwazyjności przez oocysty) zachodzi w środowisku zewnętrznym poza organizmem człowieka.
W cyklu rozwojowym Cryptosporidium parvum wyróżnia się wiele stadiów rozwojowych. Oocysta po dostaniu się do organizmu człowieka uwalnia w jelicie cienkim sporozoity, które atakują enterocyty (komórki błony śluzowej jelit), przytwierdzają się nich, a następnie przekształcają się w trofozoity. W okresie około 1 tygodnia od zarażenia trofozoity rozpoczynają etap rozmnażania bezpłciowego (schizogonię) - wytwarzane są merozoity a następnie meronty II generacji. W dalszej kolejności powstają mikro-makrogametocyty a następnie odpowiadające im mikro-makrogamety. Rozpoczyna się etap rozmnażania płciowego - gamety łączą się, powstaje zygota, która otacza się otoczką tworząc oocystę.
Oocysta jest następnie wydalana z kałem do środowiska zewnętrznego, gdzie staje się inwazyjna dla człowieka i zwierząt poprzez wytworzenie w jej wnętrzu czterech sporozoitów.



  1. Opisz morfologię komórek drożdży.

Budowa komórki drożdży:

1. ściana komórkowa zewnętrzna

2. błona komórkowa (cytoplazmatyczna)

3. cytoplazma wypełniająca wnętrze komórki

4. rybosomy

5. krystaloid (jąderko)

6. jądro

7. mitochondria

8. cząsteczki białka tzw. kryształy białka

9. wodniczki

10. lipidy

Funkcje części anatomicznych komórki drożdżowej:

Ściana komórkowa – zbudowana jest z hemocelulozy, która jest substancją stosunkowo

małotrwałą w skutek czego drożdże są podatne na samounicestwienie (autoliza).

Zjawisko to polega na uszkodzeniu ściany komórkowej pod wpływem dużego stężenia enzymu zymazy przepalającego ściany komórkowe drożdży, zjawisko samounicestwienia zachodzi np. w drożdżach prasowanych piekarskich przechowywanych w niewłaściwych warunkach (wysoka temperatura i wilgotność) lub przefermentowanych rozczynach.

Błona komórkowa – zbudowana jest z zagęszczonej cytoplazmy, posiada właściwości półprzepuszczalne przenikają przez nią do wnętrza substancje odżywcze (węglowodany, tłuszcze, białka) w postaci prostej, wydzielane natomiast są na zewnątrz enzymy i produkty przemiany materii (enzymy – zymaza, oraz produkty przemiany materii – alkohol i dwutlenek węgla).

Jądro komórkowe – zawiera kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA), którego rolą jest przekaz informacji genetycznej o budowie, składzie i funkcjach komórek potomnych.

Ponadto w skład jądra komórkowego wchodzi plazma jądrowa posiadająca charakter białkowy oraz jąderko.

Cytoplazma – jest to bezbarwna plazmoidalna ciecz o strukturze żelu, w której rozmieszczone są części anatomiczne komórki.

Substancje zapasowe i wodniczki, kropla tłuszczu, ciałko oleiste, kryształy białka – są to substancje gromadzone głównie w starszych komórkach, uzyskiwane z nadwyżek substancji odżywczych gromadzone jako materiał zapasowy posiadający charakter białkowy, tłuszczowy i węglowodanowy.

Rybosomy – odpowiadają za przekaz informacji dotyczących procesów fizjologicznych komórki takich jak oddychanie, wchłanianie przemiana materii, gospodarka enzymatyczna.

Glikogen – jest to substancja zapasowa o charakterze węglowodanowym.

Cząsteczki tłuszczu – są to substancje zapasowe składające się z tłuszczów zawierających nasycone kwasy tłuszczowe.

Klasyfikacja oraz kształty i skupiska drożdży. Kształty komórek drożdżowych: -Komórki kuliste -Komórki elipsoidalne -Komórki jajowate -Komórki mniej lub bardziej wydłużone Kształty komórek drożdży są do siebie upodobnione, w związku z czym nie mogą służyć jako cecha rozpoznawcza gatunków, kształty komórek zmieniają się wraz z wiekiem komórki i są zależne od warunków środowiska. Wielkość komórek drożdżowych: Szerokość średnio 5 μm Długość średnio 10 μm 1 μm =1 mikrometr = 0,000001цm Skupiska komórek drożdży: Drożdże tworzą skupiska w postaci łańcuszków powstałych poprzez podział komórek.



  1. Omów sposoby rozmnażania się drożdży.

Drożdże, zarówno workowe, jak i bezworkowe, cechuje charakterystyczny sposób rozmnażania bezpłciowego w postaci tzw. pączkowania. Polega ono na tym, że w pewnym miejscu komórka tworzy rosnące stopniowo uwypuklenie, do którego przechodzi jedno z powstałych po podziale jąder potomnych. Następnie wytwarza się ściana komórkowa oddzielająca komórkę potomną od macierzystej. U drożdży piekarniczych powstałe komórki są jednakowej wielkości i oddzielają się od siebie. Po oddzieleniu, na obu komórkach (potomnej i macierzystej) pozostaje trwała blizna. W miejscu starej blizny komórka nie może utworzyć nowego pączka, a więc liczba blizn świadczy zarówno o wieku komórki, jak i o jej zdolności do rozmnażania. U grzybów drożdżoidalnych komórki często nie rozdzielają się po pączkowaniu i wydłużają tworząc tzw. pseudogrzybnię w postaci rozgałęziających się łańcuszków, gron lub krzaczków. Pseudogrzybnia (pseudomycelium) to wydłużone, nitkowate struktury, często rozgałęziające się, utworzone wyłącznie przez komórki pączkujące. Struktura ta przypomina prawdziwą grzybnię (mycelium). Ta jednak utworzona jest przez komórki dzielące się, a nie pączkujące i jest charakterystyczna dla grzybów pleśniowych.

Chociaż zdolność do pączkowania jest cechą charakterystyczną większości drożdży, to nie jest to cecha wyłącznie tej grupy grzybów (zdolność do pączkowania mają też np. niektóre podstawczaki). Niektóre drożdże nie pączkują, lecz rozmnażają się bezpłciowo przez zwykły podział komórki. Są to tzw. drożdże rozszczepkowe.

Drożdże mogą również rozmnażać się przez zarodniki, czyli spory. Oprócz wspomnianych zarodników workowych, czyli askospor (wytwarzanych tylko przez drożdże właściwe w procesie płciowym), drożdże wytwarzają też zarodniki na drodze bezpłciowej. Mogą to być blastospory, które powstają w wyniku pączkowania (charakterystyczne np. dla Candida sp.) lub chlamydospory, czyli zarodniki przetrwalnikowe, charakteryzujące się grubą ścianą.

Drożdże, czyli grzyby pączkujące zalicza się do Protoascomycetes. Typowym dla nich sposobem rozmnażania bezpłciowego jest pączkowanie. Podział komórki przez rozszczepienie występuje bardzo rzadko. Wypączkowane komórki mogą pozostawać na komórkach macierzystych i mogą tworzyć pseudo- lub pączkującą grzybnię bądź wypączkowane komórki mogą się całkowicie oddzielać. Askospory są wytwarzane w nagich workach powstałych z zygoty lub z komórek

wegetatywnych.

Grzyby z rodziny Endomycetaceae, oprócz komórek pączkujących,wytwarzają grzybnię. Endomycopsis formuje w tym samym czasie strzępki, komórki pączkujące oraz worki z zarodnikami. Endomyces lactis (znany pod nazwą Geotrichum candidum lub Oospora lactis) wytwarza artrokonidia

w wyniku fragmentacji strzępek. Saccharomycetaceae (drożdże właściwe) nie mają zdolności wytwarzania grzybni. Drożdże piwowarskie i piekarniane są odmianami fizjologicznymi Saccharomyces cerevisiae. Haploidalne komórki wegetatywne mogą się ze sobą łączyć (kopulować). Po kariogamii może następować natychmiast mejoza i formują się cztery askospory. Jednakże diploidalne komórki są zdolne do wielokrotnego rozmnażania przez pączkowanie, są one większe i bardziej aktywne fizjologicznie od komórek haploidalnych.

Drożdże nie wytwarzające worków można uznać za bardziej zredukowane (tzn. mające skrócony cykl życiowy). Tylko niektóre mają rozgałęzioną grzybnię. Większość z nich rozmnaża się wyłącznie przez pączkowanie. Drożdże nie tworzące askospor zalicza się do rodzajów:

Candida, Torulopsis, Cryptococcus, Rhodotorula, Pullularia i in. W warunkach naturalnych drożdże żyją we wszystkich siedliskach, gdzie są dostępne w postaci płynnej wydzieliny lub wydaliny zawierającej cukry łatwo podlegające fermentacji, np. w nektarze kwiatów, na owocach, na liściach. Pullularia pullulans (tzw. czarne drożdże) tworzy czarne naloty na liściach pokrytych spadzią.

Sposoby rozmnażania drożdży

przez pączkowanie np. S. cerevisiae,

przez podział np. Schizosaccharomyces pombe,

worek z zarodnikami np. S. cerevisiae,

przez pączkowanie, formująca się pseudogrzybnia np. Candida pseudotropicalis


  1. Omów morfologię grzybów pleśniowych.

Jest to popularna nazwa określająca grzyby tworzące grzybnię zbudowaną z luźno skupionych strzępek, tzw. grzybnię powietrzną. Grzybnia ta tworzy charakterystyczne watowate skupienia o różnorodnym zabarwieniu (zielonym, zielononiebieskim, żółtym, różowym, białym lub czarnym). Wytwarza ona zarodniki i wyrasta z tzw. grzybni wegetatywnej, wrośniętej w podłoże, z którego pobiera substancje odżywcze. Podobnie jak drożdże, pleśnie również nie stanowią grupy jednorodnej systematycznie. Należą tu bowiem zarówno przedstawiciele grzybów niższych - sprzężniaki z rzędu pleśniakowców (pleśniak i rozłożek), jak i grzyby wyższe - workowce właściwe (kropidlak, pędzlak). Pleśnie rozmnażają się za pomocą zarodników.

Grzybnia wegetatywna jest plechą (łac. thallus).

Składa się ona ze strzępek o średnicy około 5 μm, wielokrotnie

rozgałęzionych i wrastających w podłoże lub rozrastających się na jegopowierzchni. Strzępki mają ścianę komórkową i cytoplazmę z organellami komórkowymi. S Sprzężniaki z rzędu pleśniakowców, jak pleśniak biały (Mucor mucedo), czy rozłożek czerniejący (Rhizopus nigricans) wytwarzają grzybnię nie podzieloną ścianami poprzecznymi (septami) na poszczególne komórki. Są więc komórczakami – tworzą jedną dużą wielojądrową komórkę. Wytwarzają one (bezpłciowo i na drodze płciowej) zarodniki wewnątrz kulistych zarodni (sporangiów) osadzonych na trzonkach zarodnionośnych (sporangioforach). Pleśnie te wytwarzają więc zarodniki wewnętrzne.

Pleśnie należące do workowców, kropidlaki (Aspergillus spp.) i pędzlaki (Penicillium spp.), tworzą grzybnie wielokomórkowe, a więc podzielone ścianami poprzecznymi i wytwarzają tzw. zarodniki konidialne (konidiospory), czyli konidia. Konidia to zarodniki tworzone zewnętrznie, tj. przez odcięcie końcowej (górnej) części specjalnej, pionowo wzniesionej strzępki, zwanej strzępką konidionośną albo konidioforem. Morfologia strzępek zarodnionośnych i zarodników pleśni jest podstawą ich identyfikacji. Cała strzępkowa plecha grzyba jest nazywana grzybnią (mycelium). W pewnych stadiach, zwykle w okresie przejścia w fazę rozmnażania płciowego lub bezpłciowego, grzybnia tworzy skupienia przypominające

tkankę nazywaną plektenchymą. Typową plektenchymą jest miąższ owocników pieczarki. U grzybów wyższych grzybnia może także formować grubsze sznury, tzw. ryzomorfy, które służą do transportu substancji odżywczych.



  1. Omów sposoby rozmnażania się grzybów pleśniowych.

Wzrost i rozmnażanie. Strzępki grzyba wydłużają się tylko w strefie wierzchołkowej (wzrost szczytowy). U większości grzybów każda część grzybni ma potencjalną możliwość rozwoju; mały fragment grzybni jest wystarczający jako inokulum do wytworzenia nowej plechy.

Formy i mechanizmy związane z rozmnażaniem grzybów są jednak niezmiernie zróżnicowane i są one uznawane za podstawowe w klasyfikacji.

Wyróżnia się dwa typy rozmnażania, określane jako płciowe i bezpłciowe. Większość grzybów rozmnaża się oboma sposobami.

Bezpłciowo grzyby rozmnażają się głównie przez pączkowanie, fragmentację grzybni lub dzięki tworzeniu spor. Wytwarzanie spor jest najczęstszym i najbardziej zróżnicowanym sposobem reprodukcji. Konidia (zarodniki konidialne) są zwykle formowane z wierzchołkowych części strzępek powietrznych (np. u Penicillium, Aspergillus). Gdy zarodniki

tworzą się wewnątrz sporangiów (tzn. zarodni), wówczas grzyby zalicza się do sporangiosporowych (np. Mucor, Rhizopus). U grzybów niższych zarodniki często są uwicione i nazywane wtedy zoosporami lub pływkami. Ich wić ma budowę typową dla wszystkich organizmów eukariotycznych; wyrasta ona z blefaroplastu i składa się z jedenastu równoległych włókien, z których dziewięć jest położonych peryferyjnie, a dwa - centralnie (9 + 2).

Rozmnażanie płciowe. U grzybów łączenie się jąder może następować w różnym czasie od

pierwszego zetknięcia się strzępek macierzystych. W procesie płciowym można zwykle wyróżnić trzy fazy. Najpierw następuje plazmogamia, a więc łączenie się dwu protoplastów. Powstająca komórka zawiera dwa jądra. Ta para jąder, czyli dikarion, nie musi się natychmiast połączyć, a może pozostawać w stadium dikariotycznym w czasie kolejnych

podziałów komórki, oba jądra dzielą się równocześnie (podział koniugacyjny). Łączenie się dwu haploidalnych jąder (kariogamia) może następować później, często dopiero w formującym się owocniku grzyba, a powstające jądro diploidalne jest zygotą. Po kariogamii zachodzi mejoza, podział redukcyjny przywracający haploidalną liczbę chromosomów.

Te trzy procesy, czy fazy: plazmogamia, kariogamia i mejoza mogą u niektórych grzybów następować niezwłocznie jeden po drugim, u innych zaś mogą one przebiegać w zupełnie różnych stadiach rozwojowych.

U grzybów niższych proces płciowy jest zapoczątkowany przez tworzenie gamet — komórek płciowych. Gdy gamety formujące się w męskich i żeńskich gametangiach są morfologicznie nierozróżnialne, nazywamy je izogametami. Gamety często tworzą się wewnątrz gametangiów, które różnią się od siebie, wtedy męskie gametangium jest nazywane

anteridium (plemnia), a żeńskie oogonium (lęgnia). Gdy męskie i żeńskie gametangia tworzą się na tej samej grzybni wegetatywnej (powstałej z jednego zarodnika), grzyb jest uznawany za homotalliczny, czyli hermafrodytyczny (monozoiczny). Grzyby heterotalliczne, czyli dizoiczne, mają plechy męskie lub żeńskie. Grzyby homotalliczne mogą być samozgodne płciowo (autogamiczne). Jednak u niektórych grzybów homotallicznych następuje samozapłodnienie z powodu działania fizjologicznego inhibitora, który jest odpowiedzialny za samo niezgodność (inkompatybilność). To sprawia, że np. u Neurospora, chociaż jest

homotalliczna, przy zapładnianiu niezbędne jest połączenie (koniugacja) dwu różnych typów plech (+ i —); plechy należące do tego samego typu są niezgodne płciowo.


  1. Na czym polega fotosynteza oksygenowa i jakie organizmy ją przeprowadzają?

Przeprowadzają ją glony i sinice.

Podstawowe procesy fotosyntezy odbywają się w tylakoidach. Są to spłaszczone, całkowicie zamknięte pęcherzyki błonowe występujące w komórkach sinic oraz w chloroplastach zielenic i roślin wyższych.

Błony tylakoidowe w chloroplastach zawierają chlorofil (Chl) a i Chl b, karotenoidy, przenośniki elektronóworaz enzymy. Większość cząsteczek chlorofilu (99,5%) oraz pomocniczych barwników (karotenoidy, fikobiliny) uczestniczy w absorpcji światła.

W fotosyntezie oksygenowej występują szeregowo dwa systemy pigmentów (PS I i PS II) i przekazie energii. Tworzą one system barwników anten. Obydwa fotosystemy pigmentów są połączone łańcuchem transportu elektronów i współpracują ze sobą.



  1. Na czym polega fotosynteza anoksygenowa i jakie organizmy ją przeprowadzają?

Przeprowadzają ją bakterie zielone i purpurowe.

W fotosyntezie anoksygenowej bierze udział pojedyncza reakcja świetlna, która napędza cykliczny transport elektronów. Elektrony wycofane z cyklu do redukcji NAD nie zostają odtworzone przez rozszczepienie wody. Fotosynteza jest zatem zależna od obecności w podłożu zredukowanych substancji i przebiega bez wydzielania tlenu. Chociaż przebieg właściwej reakcji świetlnej jest analogiczny do takiej reakcji u roślin, to prawdopodobnie prowadzi ona jedynie do powstania siły protonomotorycznej, a zatem do wytworzenia energii (ATP), lecz nie do redukcji NAD

Obydwa fotosystemy pigmentów są połączone łańcuchem transportu elektronów i współpracują ze sobą.



  1. Porównaj fotosyntezę oksy- i anoksygenową.

Jeśli chodzi o zamianę energii świetlnej w energię wykorzystywaną w procesach biochemicznych (ATP),to w zasadzie nie ma większych różnic między fotosyntezą bakterii fototroficznych i roślin zielonych. U bakterii purpurowych fotosynteza wydaje się ledwo wystarczać do pokrycia ilości wykorzystanej energii. Fotosynteza u sinic i roślin zielonych pod względem ewolucyjnym jest procesem bardziej rozwiniętym; ciąg dwóch kolejnych reakcji świetlnych umożliwia aktywację elektronów w pierwszej reakcji do poziomu wystarczającego do redukcji ferredoksyny i NADP. Druga reakcja świetlna pozwala następnie na wykorzystanie wody jako źródła elektronów. Poza uzyskiwaniem energii, układ ten umożliwia również redukcję NADPi wydzielanie tlenu.



  1. Scharakteryzuj purpurowe bakterie siarkowe.

Purpurowe bakterie siarkowe – są to bakterie, które w swoim metabolizmie wykorzystują mechanizm, jakim jest utlenianie siarki (tyczy się to wszystkich bakterii siarkowych). Nazywane Protobakterie. Jest to największa i najbardziej zróżnicowana grupa prokariotów. Te bakterie gromadzą siarkę w postaci silnie załamujących światło kuleczek. Są to beztlenowce, fototrofy – bo ich źródłem energii jest światło, do tego węgiel pozyskują z CO2 bo są autotrofami. Prowadzą fotosyntezę lecz beztlenową. Fotosynteza anoksygenowa. Przykłady : Chromatium. Nie są one zdolne wykorzystywać wodę jako donora wodoru więc korzystać mogą np. z siarkowodoru. Większe mają kształt fasolowaty a mniejsze to krótkie pałeczki. Kilka gatunków zawiera wakuole gazowe. Typowa cecha jednej z rodzin czyli Chromatiaceae to odkładanie siarki wewnątrzkomórkowe w trakcie utleniania siarkowodoru. Ectothiorhodospira przedstawiciele tego rodzaju akumulują siarkę na zewnątrz. Większość z bakterii purpurowych siarkowych zawiera pęcherzykowate tylakoidy (są drobne wyjątki).



  1. Scharakteryzuj purpurowe bakterie bezsiarkowe.

Purpurowe bakterie bezsiarkowe – zalicza się je do 5 rodzajów w zależności od kształtu: spiralne, pałeczkowate, zakrzywione pałeczki, zbliżone do kulistych, ogólnie posiadają wszystkie znane struktury tylakoidalne. Dwa gatunki wyróżniają sięszczególnie. Otóż Rhodomicrobium vannieli i Rhodocyclus purpureus. Pierwszy rozmnaża się przez pączkowanie, pączki pozostają połączone z komórką macierzystą przez łodyżki podobne do strzępek lub uwalniają sięw postaci perytrychalnie urzęsionych ruchliwych komórek. A Ten drugi rodzaj to jedyna forma z tej rodziny która jest nieruchliwa. Jego komórki są półokrągłe błona fotosyntetyzująca najprawdopodobniej podobna do plazmatycznej tylko silnie pofałdowana.

Wzrost większości bakterii bezsiarkowych hamowany jest przez siarkowodór choć niektóre tolerują ten związek.



  1. Scharakteryzuj zielone bakterie siarkowe.

Zielone bakterie siarkowe – w bezpośrednim sąsiedztwie błony cytoplazmatycznej mają organelle zawierające pigmenty (barwniki) – organelle te to tzw. Chlorosomy znane jako pęcherzyki Chlorobium. Zawierają one bakteriochlorofil c,d lub e, czyli pigment anten. Oraz zawierają niewielkie ilości bakteriochlorofilu a. Od bakterii purpurowych różni te bakterie brak enzymu karboksylazy rybulozobisfosforanowej – nie wiążą zatem CO2. Zaliczamy do tego typu bakterii dwie rodziny, które różnią się od siebie. Chlorobiaceae gramujemne i Chloroflexaceae gramdodatnie.

Te pierwsze mają zielone lub brązowe zabarwienie i tworzą skupiska przypominające gwiazdę lub sieć.

Bakterie drugiej grupy to fototrofy są to bakterie nitkowate o ruchu ślizgowym. Zawiera bakteriochlorofil c i a oraz chlorosomy podobne do chlorosomów gatunku Chlorobium. Z drugiej strony różni się tych wymienionych przed chwilą tym, że ma zdolność do heterotroficznego wzrostu na złożonych podłożach zarówno w ciemności i w świetle. Prawie niewykorzystuje H2S i CO2. Jest szeroko rozpowszechniony na całym świecie żyje na dnach kanałów (zielone i pomarańczowe kolory) i w wyciekach z gorących źródeł.



  1. Scharakteryzuj zielone bakterie bezsiarkowe.

Bakterie z grupy Chlorofexaceae. Zawierają struktury podobne do chlorosomów i bakterio chlorofil a i c. Są tlenowcami. CO2 nie wiążą w cyklu Calvina, lecz w szlaku hydroksypropionowym. Jako źródło elektronów do redukcji NAD wykorzystują związki organiczne, rzadko H2S lub H2. Potrafią żyć bez światła i odżywiać się heterotroficznie. Mają postać nitkowatą i często tworzą maty.



  1. Charakterystyka Halobacterium halobium.

Nie jest autotrofem – odżywia się heterotroficznie, a energia uzyskiwana z fotofosforylacji uzupełnia energię otrzymywana z oddychania tlenowego.



  1. Na czym polega fotosynteza bakteryjna i jakie ma znaczenie w przyrodzie?

Bakterie purpurowe tworzą odmienny typ metaboliczny: purpurowe bakterie siarkowe i bezsiarkowe na świetle asymilują, odpowiednio: dwutlenek węgla oraz substancje organiczne. Ten typ fotosyntezy odbiega jednak zasadniczo od fotosyntezy roślin wyższych. Po pierwsze, nie wykorzystuje wody jako donora wodoru dla fotosyntezy, nie powstaje zatem wolny tlen. Po drugie, zużywa siarkowodór lub substancje organiczne jako donory wodoru (czego nie potrafią rośliny zielone). W wyniku dalszych badań nad bakteriami purpurowymi. W fotosyntezie bakteryjnej siarkowodór odgrywa taką rolę, jak

woda w fotosyntezie roślin wyższych.



  1. Na czym polega chemosynteza i jakie ma znaczenie dla człowieka? Chemosynteza- biochemiczny proces przyswajania analogiczny do fotosyntezy, lecz zachodzący bez udziału światła, kosztem energii chemicznej uzyskiwanej z procesu utleniania tlenem atmosferycznym . prostych substancji nieorganicznych, jak wodór, siarka, siarkowodór, amoniak, lub organicznych, jak metan; uzyskana w tych procesach energia pozwala organizmom na związanie dwutlenku węgla i wody, i syntetyzowanie z nich własnych związków organicznych; do chemosyntezy są zdolne nieliczne gat. bakterii, zw. chemoautotrofami, z których najważniejsze to: 1) bakterie wodorowe, utleniające wodór cząsteczkowy do wody, 2) bakterie siarkowe, utleniające siarkowodór, siarkę i tiosiarczany do siarczanów, 3) bakterie nitryfikacyjne, utleniające amoniak, sole amonowe i azotyny do azotanów (nitryfikacja), 4) bakterie żelazowe, utleniające jony żelaza Fe2+ do jonów Fe3+. Proces chemosyntezy odgrywa ważną rolę w krążeniu pierwiastków w przyrodzie, a także w tworzeniu się niektórych złóż, np. azotanów (saletry), rud żelaza, manganu. Można ją podzielić na dwa etapy: 1.Utlenienie związku nieorganicznego i uzyskanie energii związek nieorg. zredukowany+tlen → związ. Nieorg. Utleniony+ energia ATP, NADPH2 2.Synteza związków organicznych:

CO2+H2O+Energia → glukoza + tlen Udział w krążeniu pierwiastków w biosferze (S, N, C, Fe), Usuwanie toksycznego H2S i NH3,Produkcja materii organicznej bez udziału światła, Udział w procesie glebotwórczym i tworzeniu złóż

Znaczenie dla człowieka:

1. wykorzystanie w procesie oczyszczania ścieków

(nitryfikacja i anamoks, metanogeneza),

2. wykorzystanie w procesie bioługowania

(chemosynteza siarkowa i żelazowa),

3. znaczenie negatywne: korozja, wytrącanie Fe III


  1. Na czym polega chemosynteza siarkowa i żelazowa, jakie mikroorganizmy ją przeprowadzają?

2H2S + O2 → 2S +2H2O + energia ogólne równanie reakcji chemosyntezy siarkowej

Chemosynteza siarkowa polega na uzyskiwaniu związków organicznych z utleniania różnych związków siarki, np. siarkowodoru. Powstająca wolna siarka jest wydzielana na zewnątrz lub gromadzona w komórce. Siarkowe bakterie występują pospolicie na całej kuli ziemskiej, ich działalność przyczyniła się do powstania złóż siarki.

Mikroorganizmy: Thiobacillus , bakterie z rodzaju Beggiatoa , bakterie z rodzaju Thiotrix

Analogicznie chemosynteza żelazowa polega na tworzeniu związków ogranicznych z utleniania związków żelaza.

4 Fe2+ + 4H++ O2 → 4Fe3+ + 2H2O + energia

Bakterie – Ferrobacillus, Galionella, Thiobacillus


  1. Na czym polega nitryfikacja i jakie mikroorganizmy ją przeprowadzają?

Nitryfikacja to proces biologicznego utleniania amoniaku do azotanów zachodzący przy

udziale bakterii nitryfikacyjnych. Nitryfikacja to przekształcenie NH4 + i NO2 - do NO3

-prowadzone głównie przez chemolitotrofy. Uwolniona w tym procesie energia jest wykorzystywana do syntezy związków organicznych.

Nitryfikacja przebiega dwuetapowo:

Najpierw amoniak jest utleniany do azotynu, bakterie utleniające NH4 do NO2

określane są przedrostkiem „nitroso-”. Należą tu m.in.: Nitrosomonas, Nitrosospira,

Nitrosocyjastis, Nitrosoglea. Są to bakterie właściwe, mają kształt drobnych pałeczek.

Następnie powstały azotyn jest utleniany do azotanu, azotyny do azotanów utlenia

grupa „nitro”: np. rodzaj Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus.

Obie grupy bakterii nitryfikacyjnych są wrażliwe na zakwaszenie środowiska;

zahamowanie ich wzrostu następuje przy pH 5.0.

Proces nitryfikacji może być prowadzony także przez mikroorganizmy heterotroficzne.

Największą grupą mikroorganizmów przeprowadzających heterotroficzną nitryfikację są

grzyby:Aspergillus flavus, Penicillium, Cephalosporium. Nitryfikacja prowadzona przez

grzyby jest mniej wrażliwa na zakwaszenie i bardziej odporna na suszę.

Wytworzone w glebie azotany mogą być przyswajane przez rośliny, wypłukiwane przez

wodę lub rozkładane w procesie denitryfikacji.


  1. Na czym polega reakcja anamoks i jakie mikroorganizmy ją przeprowadzają?

Anamoks - proces beztlenowego utleniania amoniaku przeprowadzany przez bakterie.
preferowanymi
akceptorami elektronówazotyny (azotany (III)), a nie azotany (V) i że reakcja przebiega w następujący sposób:

NH4+ + NO2- → N2 + 2 H2O ΔG = -358 kJ/mol NH4+

Produktami pośrednimi w tym procesie są hydroksylamina i hydrazyna. Jednym z głównych enzymów biorących udział w reakcji anammox jest oksydoreduktaza hydroksylaminy, która prowadzi utlenianie zarówno hydroksylaminy, jak i hydrazyny. Enzym ten znajduje się w organellum zwanym anamoksosomem.
Bakterie przeprowadzające reakcje anammox należą do 3 rodzajów:
- brocadia
- kuenenia
- scalindua

Aktywność bakterii prowadzących tę reakcję jest 25 razy większa niż tlenowych nitrozobakterii utleniających amon w warunkach denitryfikacyjnych (beztlenowych) i 7 razy mniejsza niż aktywność nitrozobakterii utleniających amon w warunkach tlenowych.


  1. Omów rodzaje rozmnażania u bakterii.

Rozmnażanie bezpłciowe
Bakterie rozmnażają się przez prosty podział komórki (rozszczepianie), przy czym z jednej komórki macierzystej powstają, po wytworzeniu poprzecznej błony, dwie komórki potomne. Pierwszy etap to podział substancji jądrowej. Występuje on w fazie intensywnego wzrostu komórki. Kolisty chromosom bakteryjny ulega w wyniku replikacji podwojeniu. Po skończonym podziale nukleoidu następuje właściwy podział komórki bakteryjnej, tworzy się poprzeczna przegroda (septum) rosnąca od zewnątrz do środka komórki. Stanowi ona następnie ścianę komórkową odgradzającą nowo powstałe komórki. Istotny jest brak wrzeciona kariokinetycznego, jakie podczas mitozy tworzy się u Eukaryota.
U bakterii nie stwierdzono rozmnażania płciowego, wykryto natomiast procesy płciowe umożliwiające pewną wymianę materiału genetycznego między różnymi komórkami bakteryjnymi.
1. Koniugacja:
Przenoszenie dziedzicznych cech szczepu dawcy na szczep biorcy przez bezpośredni kontakt w parach określa się mianem koniugacji. Połączenie się 2 bakterii zachodzi poprzez mostek cytoplazmatyczny utworzony przez pili płciowe. Koniugują tylko bakterie F+ (dawca, zawiera czynnik płciowy F i może wytwarzać pili płciowe) z bakterią F- (biorca, nie ma czynnika F). Podczas koniugacji biorca może uzyskać czynnik F i zacznie wytwarzać pili płciowe, stanie się dawcą.
2. Transformacja:
Przekazanie cech genetycznych szczepom biorcy z pominięciem łączenia w pary, za pomocą wolnego rozpuszczalnego DNA uzyskanego od dawcy.
3. Transdukcja:
Jest to proces przenoszenia fragmentu DNA z jednej komórki do drugiej przez bakteriofaga łagodnego (w czasie cyklu lizogenicznego). Fag taki wbudowuje część bakteryjnego DNA w swój własny kwas nukleinowy i przenosi go jako trwałą cechę na szczep biorcy.


  1. Omów cykl rozwojowy Chlamydia pneumoniae, Bdelliovibrio sp. i bakterii śluzowych.

Bakterie śluzowe
Bakterie śluzowe to ścisłe tlenowce chemoheterotroficzne, zdolne do ruchu pełzającego
Cykl rozwojowy z wytworzeniem ciał owocowych:
Po wytworzeniu skupiska komórek powstaje ciało owocowe, składające się ze śluzowej nóżki i z cyst. Cysty są organami do rozprzestrzeniania i w czasie kiełkowania uwalniaja mikrospory, które rozwijają się w komórki wegetatywne.
Bdellovibrio
Jest tlenowym mikroorganizmem pasożytującym na innych bakteriach Napotkawszy na odpowiednią bakterie żywiciela pasożyt ten przywiera nieurzęsionym biegunem do jej ściany komórkowej i obraca się wokół swej osi podłużnej. Wkrótce potem zaatakowana komórka przekształca się w formę kulistą ,podobną do sferoplastu. Bdellovibrio penetruje jej ścianę komórkową i umiejscawia się w przestrzeni peryplazmatycznej . Komórka rośnie i wydłuża się, aż do chwili kiedy zostaną wyczerpane związki pokarmowe ze stopniowo malejącego protoplastu żywiciela. Forma cylindryczna dzieli się wielokrotnie, dając komórki o jednakowych rozmiarach. W końcu ściana komórkowa gospodarza ulega lizie i do podłoża zostaje uwolnione potomstwo pasożyta gotowe do zaatakowania nastepnych bakterii.
Chlamydia pneumoniae:
Chlamydie są patogenami ludzi,na podstawie cech biologicznych zalicza się je do prokariotów. Syntetyzują związki, których nie potrafią syntetyzować komórki eukariotyczne, takie jak kwas muraminowy, kwas foliowy i kw. diaminopimelinowy.
Wszystkie bakterie z tej grupy mają podobny cykl reprodukcji. Ciałka elementarne (EB elementary bodies), malutkie komórki o średnicy około 300 nm. Zawierają nukleoid. Są to formy inwazyjne dla komórek, do których wnikają w wyniku fagocytozy. Po 6-8 godzinach przekształca się w ciałko pierwotne o rozmiarach od 0.5 do 1 μm, które pozbawione jest nukleoidu (pozostaje wodniczka) i błon powierzchniowych z komórki gospodarza. Wewnątrz znajduje się ciałko RB (reticulate body). W ciągu następnych 18-24 godzin ciałko powiększa się,a zawarte RB ulegają wielokrotnym podziałom. Otaczająca je wodniczka wypełnia się ciałkami wtrętowymi. Następnie ciałka są uwalniane poza komórkę i już jako ciałka EB zakażają kolejne komórki powtarzając cykl.


  1. Co to są formy L u bakterii i formy pleomorficzne?


  1. Podział komórki bakteryjnej i wzrost populacji bakterii w czasie.


  1. Hodowla okresowa-charakterystyka ogólna.

W hodowli statycznej (okresowej) mikroorganizmy posiane do pożywki rosną i rozmnażają się do czasu wyczerpania się składników pokarmowych lub (i) nagromadzenia się toksycznych produktów przemiany materii. W tego typu hodowli rozwój populacji bakterii przebiega w kilku charakterystycznych fazach, które można zobrazować na wykresie w postaci tzw. krzywej wzrostu:

  • faza zastoju,

  • faza wzrostu logarytmicznego (wykładniczego),

  • faza stacjonarna,

  • faza zamierania.

  1. W fazie zastoju w zaszczepionych komórkach (inokulum) zachodzą procesy adaptacji polegające na syntezie potrzebnych enzymów, replikacji DNA, syntezie białek i w efekcie komórki zwiększają swoje rozmiary. Długość tej fazy zależy od podobieństwa warunków hodowli poprzedniej (z której pochodzi inokulum) do warunków panujących w nowej hodowli. Im jest ono większe, tym faza jest krótsza.

  2. W fazie wzrostu logarytmicznego komórki zaczynają się dzielić. Sygnałem do podziałów jest osiągnięcie przez komórki odpowiedniej długości. Każda komórka dzieli się na dwie. Po określonym czasie wzrostu powstałe komórki znowu dzielą się na dwie, stąd liczbę powstałych komórek (czyli wzrost populacji) określa wzór 2n, gdzie n – to liczba podziałów, która jest równoznaczna z liczbą pokoleń. Czas między dwoma kolejnymi podziałami, to tzw. czas generacji lub wiek osobniczy. Zależy on od warunków hodowli i od cech gatunkowych drobnoustroju. W konkretnej hodowli jest on więc stały. Jeśli liczba komórek w inokulum wynosi N0, to powstała liczba komórek N po n pokoleniach wyniesie N = N0 x 2n. Liczba bakterii podwaja się co każdy okres generacji, rośnie więc wykładniczo z upływem czasu. Do czasu hodowli proporcjonalny jest więc logarytm liczby bakterii, a nie sama ich liczba. Stąd nazwa – faza logarytmiczna.

  3. W fazie stacjonarnej obserwuje się spadek przyrostu liczby bakterii, w wyniku zamierania części komórek z powodu wyczerpywania się składników pokarmowych, tlenu i wytwarzania produktów przemiany materii. Zamieranie to jest w pewnej równowadze z dzieleniem się innych komórek

  4. Z czasem komórek zamierających jest więcej i dochodzi do spadku ogólnej liczby komórek – hodowla się przerzedza i z czasem zamiera.


  1. Wyjaśnij pojęcie wydajności (plonu hodowli)

Wydajnością, plonem lub uzyskiem nazywa się masę bakteryjną wytworzoną w chwili osiągnięcia fazy stacjonarnej (jedna z faz wzrostu bakterii w hodowlach okresowych, która rozpoczyna się w momencie gdy komórki mogą już się reprodukować). Zależy to od rodzaju składników odżywczych pożywki oraz warunków hodowli. Wydajność jest różnicą między początkową a maksymalną masą bakteryjną: X=Xmax – X0. Wartość ta jest wyrażana w gramach suchej masy.

  1. Wyjaśnij pojęcie swoistej szybkości wzrostu bakterii.

Jest to miara szybkości wzrostu komórek. Oblicza się ją z gęstości bakterii x0 i xt, odpowiednio w czasie t0 i czasie t.


  1. Hodowla ciągła-charakterystyka.

Jednak opisana sekwencja zdarzeń w hodowli może być inna. Jeśli tylko zapewni się usuwanie zużytego podłoża i zastępowanie go świeżym, to możliwe jest utrzymywanie fazy wzrostu logarytmicznego praktycznie w nieskończoność. Na tym właśnie polega hodowla ciągła. Jest więc ona, w przeciwieństwie do hodowli statycznej, układem otwartym, z ciągłym przepływem pożywki (zużytej i świeżej). Prowadzi się ją w tzw. chemostatach, umożliwiających kontrolowanie wzrostu komórek za pomocą dozowania odpowiednich ilości pożywki i regulowania szybkości przepływu. Dzięki temu możliwe jest uzyskanie stanu równowagi, w którym zagęszczenie komórek jest stałe. Ma to duże znaczenie w badaniach procesów fizjologicznych drobnoustrojów, kiedy niezbędne są warunki stabilne. Hodowle ciągłe są wykorzystywane m.in. w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym, do produkcji określonych substancji (np. kwasu octowego, antybiotyków) i biomasy (np. drożdży). Hodowle w procesach produkcyjnych prowadzi się w bioreaktorach (fermentorach). Rodzajem hodowli ciągłej jest również biologiczna oczyszczalnia ścieków, w której hoduje się bakterie (jako tzw. osad czynny) na bazie pożywki, jaką stanowią ciągle dopływające ścieki.


  1. Hodowla zsynchronizowana-charakterystyka.

Hodowla zsynchronizowana to hodowla, w której komórki dzielą się równocześnie (czyli synchronicznie), w przeciwieństwie do innych hodowli, gdzie podziały komórek są nieskoordynowane. Dzięki jednoczesności podziałów, zmiany w hodowli synchronicznej są odzwierciedleniem (zwielokrotnieniem) zmian w pojedynczej komórce. Umożliwia to badanie przemian zachodzących w cyklu życiowym komórki, zwykle nieuchwytnych ze względu na zbyt małą czułość metod badawczych. Zsynchronizowanie podziałów można osiągnąć wieloma metodami, m.in. przez szok wywołany niską temperaturą. Bakterie przenosi się na ok. 15 – 60 min. do temperatury dużo niższej od optymalnej. W tych warunkach dochodzi do zrównania stanu fizjologicznego komórek, które przeniesione do temperatury optymalnej, równocześnie zaczynają podziały komórkowe. Osiągnięta synchronizacja nie jest trwała i, jeśli nie jest utrzymywana, szybko spontanicznie zanika.


  1. Omów skład, wielkość i zdolność penetracji dróg oddechowych aerozolu biologicznego.

Mikroorganizmy w powietrzu tworzą układ koloidalny w postaci aerozolu biologicznego (bioaerozolu). W przypadku aerozoli biologicznych ośrodkiem dyspersyjnym jest powietrze (lub inny gaz), a fazą rozproszoną - mikroorganizmy.

Bioaerozol może mieć postać dwóch rodzajów faz:

  • fazy pyłowej (np. powstającej dzięki ruchom powietrza unoszącym kurz)

  • fazy kropelkowej (np. powstającej w wyniku kondensacji pary wodnej lub w czasie kichania)

Wielkość cząstek bioaerozolu

  • Średnica cząstek obejmuje zakres

od ok. 0,02µm do 100µm.

  • Stosując kryterium wielkości można podzielić aerozol biologiczny na:

  • drobnoziarnisty (poniżej 1µm)

  • gruboziarnisty (powyżej 1µm)

Wpływ wielkości cząstek bioaerozolu na penetrację dróg oddechowych:

  • Bioaerozol gruboziarnisty osadza się głównie w jamie nosowo-gardłowej (szczególnie cząstki o średnicy powyżej 10µm) i drzewie oskrzelowym, tzn. tchawicy, oskrzelach i oskrzelikach (cząstki o średnicy 2 - 10µm)

  • Bioaerozol drobnoziarnisty przenika głębiej, aż do pęcherzyków płucnych (cząstki o średnicy 1 µm i mniejszej)

  • Frakcjia respirabilna (łac. respirare - oddychać) to cząstki, które mogą przenikać w głąb płuc (do oskrzelików i pęcherzyków płucnych)


  1. Opisz mechanizmy obronne organizmu człowieka przed wnikaniem bioaerozolu.

Mechanizmy usuwające bioaerozol z wdychanego powietrza:

-aparat śluzowo rzęskowy

-fagocytoza mikrofagów płuc

Drogi oddechowe człowieka wyściełane są nabłonkiem wielorzędowym. Nabłonek zaopatrzony jest w komórki wytwarzające rzęski, pokryty jest śluzem, wytwarzanym przez komórki kubkowe. Śluz en ma wysoką lepkość( zawiera mucynę), ma właściwości bakteriobójcze, dzięki zawartości lizozymu- enzym rozpuszczający ściany komórkowe bakterii Gram+.

Oba typy komórek tworzą aparat śluzowo rzęskowy. Cząstki zawarte w powietrzu przyklejają się do śluzu, następnie są wymiatane do jamy nosowo gardłowej i wydalane ze śliną lub połykane. Ta metoda skuteczna jest dla aerozolu gruboziarnistego.

Bioaerozol drobnoziarnisty może dostać się do pęcherzyków płucnych. Tam może zostać pochłonięty przez obecne tam makrofagi, mające zdolność do fagocytozy.

Inne metody to

-wyłapywanie większych cząstek przez włoski w otworach nosowych

-odruch kaszlowy

-przez hamujące działanie naturalnej mikroflory błony śluzowej dróg oddechowych(interferencja bakteryjna)


  1. Omów czynniki wpływające na stężenie drobnoustrojów w powietrzu.

- wielkość emisji drobnoustrojów, zależna od źródła emisji

-odległość od źródła emisji

-prędkość wiatru

-przeżywalność drobnoustrojów

-opady atmosferyczne

Wielość emisji i skład gatunkowy emitowanego bioaerozolu zależy od źródeł emisji. Są różne czynniki wpływające na stężenie początkowe powstającego bioder. Np. dla komory napowietrzania biologicznej oczyszczalni ścieków są to m. In: stężenie mikroorganizmów w ściekach i sposób ich napowietrzania.

Stężenie musi być odpowiednio duże, bo w przeciwnym razie nie dojdzie do powstania bioaerozolu. Określa to tzw. próg emisj9 dla ścieków 10^3 w 1 cm3).

Powstały bioaerozol rozprzestrzenia się podobnie jak aerozol niebiologiczny, z tą różnicą, że mikroorg z czasem zamierają. Wiejący wiatr rozrzedza aerozol, stężenie na zawietrznej od źródła emisji zmniejsza się.

Dodatkowo stężenie bioaer. zmniejsza grawitacja(działa głównie na większe cząstki), oraz opad atmosferyczny(niekiedy radykalnie redukuje ilość bioaero.)

Na przeżywalność mikroorganizmów w powietrzu wpływa:

-odporność właściwa dla danego mikroorganizmu

-warunki meteorologiczne(wilgotność, temp, promieniowanie, zanieczyszczenia powietrza)

-zanieczyszczenie powietrza

-czas przebywania w powietrzu

-zdolność wytwarzania form przetrwanych


  1. Mokroorganizmy chorobotwórcze przenoszone drogą powietrzną i wywoływane przez nie choroby.

W powietrzu obecne są: bakterie, grzyby, wirusy, (też ich formy przetrwale bakterii- endospory, zarodniki grzybów)

Grupy zagrożeń:

-choroby zakaźne- wirusy, bakterie grzyby, pierwotniaki

-choroby alergiczne

-zatrucia(endotoksyny, mikotoksyny)

Choroby wirusowe

-Grypa-o rtomyxowirusy

-odra, świnka- paramyxowirusy

-zapalenie opon mózgowych- enterowirusy

Choroby bakteryjne:

-gruźlica płuc- prątki gruźlicy Mycobacterium tuberculosis

-zapalenie pluc- gronkowce, pneumokoki Streptococcus pneumoniea

-angina- paciorkowce

-ropne zapalenie dolnych i górnych dróg oddechowych- pleomorficzne pałeczki Haemophilus

-nokardioza- promieniowce z rodzaju Nocardia

-legionellozy- pałeczki z rodzaju Leginella

Choroby grzybowe:

-grzybice powierzchniowe- Microsporum racemosum

-grzybice głęboki: aspergiloza-kropidlak Aspergillus fumigatus; kryptokokoza- drożdżak Cryptococcus neoformans

-astma oskrzelowa- cladosporium

Choroby pierwotniacze:

Nie dotyczą człowieka; np. pryszczyca u zwierząt parzystokopytnych

Dodatkowe informacje:

Grzyby występujące w powietrzu to min: Penicillum, Aspergillus( niger, flavus), Rhizopus microsporus.

Ich obecność w powietrzu może powodować: wady wrodzone, niska masa ciała urodzeniowa, poronienia, bóle głowy, zaburzenia czynności wątroby, dolegliwości neurologiczne, zmiany skórne, podrażnienia błon śluzowych, układu oddechowego oraz nowotwory min: płuc , wątroby. Niektóre grzyby pleśniowe wytwarzają toksyczne metabolity tzw mykotoksyny. Aspergillus flavus wytwarza alfatoksyny, Aspergillus ochraceus – ochratoksyny. Powodują one mykotoksykozy i śmierć.

Bakterie saprofityczne:

-Pseudomonas aeruginosa – gram ujemna, pałeczka, żyje głównie w glebie i wodzie; pałeczka ropy błękitnej Pseudomonas aeruginosa to bakteria, która często atakuje ludzi przewlekle chorych i długo leżących w szpitalu. Jej obecność w płucach wywołuje przewlekły proces zapalny, który w końcu prowadzi do zniszczenia dużych obszarów tkanki płucnej, skurczów oskrzeli wywołanych reakcją zapalną i poważnych kłopotów z oddychaniem.

-Staphylococcus ureus- to gronkowiec złocisty, gram dodatnia bakteria. Charakterystycznymi objawami zatrucia gronkowcem są: wymioty, biegunka, spadek ciśnienia krwi, zapaść a nawet śmierć. Bakteria ta jst odporna na wysokie temperatury. Wywołuje tez zakażenia ropne skóry, czyraki.

Termofilne promieniowce są nitkowatymi, zarodnikującymi bakteriami, które rozwijają się w wysokiej temperaturze, w zanieczyszczonych urządzeniach klimatyzacyjnych. Liczne gatunki mikroorganizmópuje proces samo zagrzewania do temperatury. Np:, Thermoactinomyces thalpophilus , Saccharomonospora viridis , Thermomonospora Fusa, są znaną przyczyną alergicznego zapalenia pęcherzyków płucnych.


  1. Omów bioaerozol jako czynnik alergiogenny.

Wielkość cząstek bioaerozolu a choroby alergiczne:

  • cząstki powyżej 10mm, zatrzymywane w jamie nosowo-gardłowej, powodują katar sienny (np. zarodniki grzyba Alternaria, pyłki traw)

  • cząstki o średnicy 4-10mm, zatrzymywane w oskrzelach, powodują astmę oskrzelową (np. zarodniki grzyba Cladosporium)

  • cząstki poniżej 4mm, przenikające do oskrzelików i pęcherzyków płucnych, wywołują alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych, a także astmę oskrzelową (zarodniki grzybów Aspergillus i Penicillium, większość bakterii, w tym termofilne promieniowce).


  1. Omów toksyny występujące w powietrzu i sposób ich wykrywania.

Endotoksyny

toksyny występujące w błonie zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych. Jest to kompleks lipopolisacharydowy wchodzący w skład zewnętrznych warstw komórki bakterii Gram-ujemnych. Endotoksyna jest uwalniana po rozpadzie (lizie) komórki. Na organizm człowieka działają toksycznie, są jednak mniej groźne od egzotoksyn. Wywołują:

- głębokie zaburzenia naczynioruchowe

- gorączkę

- zaburzenia metabolizmu cukrów, tłuszczów i białek

- zaburzenia krzepnięcia

- drażnią skórę

- obniżają fagocytozę

Są stosunkowo trwałe chemicznie, odporne na ogrzewanie w temp. 60 °C przez kilka godzin. Lps jest antygenem i wywołuje odpowiedź immunologiczną.

Wykrywanie toksyn i endotoksyn w powietrzu:

Wykrywanie toksyn i alergenów występujących w powietrzu wymaga często żmudnych badań. Badanie na ich obecność opiera się przede wszystkim na wywoływaniu reakcji immunologicznej z użyciem przeciwciał skierowanych przeciwko znanym antygenom oraz badaniach chromatografi cznych, np. w przypadku mikotoksyn. Wykrywanie endotoksyn występujących w powietrzu wymaga podjęcia następujących działań [2]: przefi ltrowania powietrza przez filtr membranowy (z włókna szklanego lub PCV), rozcieńczania odfi ltrowanych komórek z preparatem z krwi skrzypłocza (morski stawonóg) z dodatkiem substancji chromogennej, wykonania pomiaru wytworzonej lu-minescencji.


  1. Wymień bytowe źródła bioaerozolu i omów jedno z nich.

Z higienicznego punktu widzenia, ważniejsze od naturalnych są bytowe źródła bioaerozolu, związane z działalnością człowieka. Emisje z tych źródeł są niebezpieczne z dwóch powodów:

- mogą rozprzestrzeniać drobnoustroje patogenne (chorobotwórcze)

- często powodują silne zwiększenie liczebności mikroorganizmów w powietrzu, znacznie przekraczające naturalne tło.

Źródła emisji aerozolu biologicznego mogą mieć charakter punktowy (np. komora napowietrzania ścieków) lub powierzchniowy (np. pole nawadniane ściekami).

Do najważniejszych źródeł bioaerozolu należą:

- rolnictwo i przemysł rolno-spożywczy

- oczyszczanie ścieków

- gospodarka odpadami

Rolnictwo i przemysł rolno-spożywczy

Pod względem wielkości emisji jest to najpoważniejsze źródło bioaerozolu, będące efektem intensyfikacji metod produkcji rolnej. Aerozol powstaje podczas wykonywania większości prac rolniczych, np. zbioru plonów, w czasie transportu, przechowywania i przerobu surowców roślinnych i zwierzęcych, oraz w pomieszczeniach hodowlanych.

Zagrożenie dla zdrowia człowieka stwarza tu olbrzymia ilość mikroorganizmów, produktów ich rozkładu i pyłu organicznego, które działają głównie alergicznie i toksycznie. Obecność drobnoustrojów zakaźnych ma tu mniejsze znaczenie.

Do najważniejszych składników tego aerozolu należą:

- grzyby pleśniowe, m.in. tzw. grzyby przechowalniane i tzw. grzyby polowe,

- pałeczki gramujemne, głównie z rodzaju Ervinia,

- promieniowce termofilne,

- pył pochodzenia biologicznego.

Ekspozycja na taki aerozol często powoduje przewlekłe choroby układu oddechowego, np. alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych. Uważa się, że szczególne zagrożenie dla zdrowia powstaje, gdy ponad 50% aerozolu należy do frakcji respirabilnej, a stężenie bioaerozolu przekracza 10^5 cfu/m3. Wielkość ta jest często przekraczana ponad stukrotnie(np. w chlewniach, spichrzach zbożowych).


  1. Wymień i omów mikroorganizmy wskaźnikowe sanitarnej analizy powietrza.

Do stosowanych w sanitarnej analizie powietrza mikroorganizmów wskaźnikowych należą m. in.:

  1. gronkowce hemolizujące,

  2. gronkowce mannitolododatnie i mannitoloujemne,

  3. promieniowce,

  4. pałeczki Pseudomonas fluorescens.

Gronkowce to jedne z najpospolitszych bakterii w przyrodzie. Nie wszystkie są chorobotwórcze, wiele z nich występuje na skórze i błonie śluzowej człowieka nie powodując chorób. Gatunki chorobotwórcze wykazują wysoką aktywność metaboliczną, dzięki której można je odróżnić od niechorobotwórczych.

Gronkowce chorobotwórcze wywołują m. in.:

  • całkowitą hemolizę krwinek czerwonych (erytrocytów) na agarze z krwią - hemoliza polega na rozkładzie erytrocytów przez pewne toksyny produkowane przez bakterie, co przejawia się powstawaniem charakterystycznych przejaśnień wokół kolonii.

  • kwaśną fermentację mannitolu na podłożu Chapmana – podłoże Chapmana zawiera 10% NaCl, co powoduje, że wyrastają na nim głównie gronkowce, odporne na duże stężenie soli. Obecność w podłożu mannitolu (wielowodorotlenowego alkoholu) pozwala zróżnicować gronkowce na mannitolododatnie (zdolne do fermentacji mannitolu) i mannitoloujemne (niezdolne). Stwierdzenie hemolizy i fermentacji mannitolu zwiększa prawdopodobieństwo, że wykryte gronkowce są chorobotwórcze.

Promieniowce to typowe bakterie glebowe. W przeciwieństwie do innych bakterii, komórki promieniowców mają często postać rozgałęziających się nitek i mogą tworzyć tzw. pseudogrzybnię, podobnie jak strzępki grzybów. Z tego powodu wytwarzają one charakterystyczne meszkowate kolonie na podłożu Pochona. Wiele promieniowców ma zdolność wytwarzania antybiotyków (promieniowcowym antybiotykiem jest np. streptomycyna). Obecność promieniowców w powietrzu może wskazywać na środowisko glebowe jako źródło zanieczyszczenia powietrza.

Bakteria Pseudomonas fluorescens jest pospolitą bakterią wodną. Na podłożu Kinga B wytwarza ona barwniki fluoryzujące powodujące świecenie kolonii w świetle UV. Obecność tych bakterii w powietrzu może wskazywać na środowisko wodne jako źródło zanieczyszczenia.

Poza tym w badaniu zanieczyszczenia mikrobiologicznego powietrza wokół określonego emitora, wykorzystuje się gatunki charakterystyczne dla tego emitora. Pozwala to na wyznaczenie strefy jego oddziaływania na stan sanitarny powietrza – granicę oddziaływania będzie wyznaczał obszar występowania mikroorganizmu wskaźnikowego. I tak np.:

  • dla rolnictwa i przemysłu spożywczego:

    • grzyby pleśniowe, m. in. tzw. grzyby przechowalniane (Aspergillus, Penicillium) i tzw. grzyby polowe (Cladosporium i Alternaria), najpospolitsze grzyby w powietrzu,

    • pałeczki gramujemne, głównie z rodzaju Ervinia,

    • promieniowce termofilne,

    • pył pochodzenia biologicznego (m. in. fragmenty naskórka, pierza, cząstki wydalin i pył roślinny).

  • dla oczyszczalni ścieków za najbardziej specyficzne uważa się bakterie jelitowe (pałeczki z grupy coli - to przede wszystkim szczepy Escherichia coli oraz drobnoustroje z rodzaju Enterobacter, Citrobacter i Klebsiella, wykrywane są one na podłożach z laktozą po inkubacji w temperaturze 37oC, bakterie grupy coli typu kałowego – termo tolerancyjne – to głównie szczepy Escherichia coli i tylko te nieliczne szczepy z rodzajów Enterobacter, Citrobacter i Klebsiella, które mają zdolność fermentacji laktozy w temperaturze 44 oC; pałeczki durowe) i wirusy jelitowe, gdyż zazwyczaj nie spotyka się ich w powietrzu po stronie nawietrznej oczyszczalni. Z tego powodu uważa się je za mikroorganizmy wskaźnikowe, pomocne w wyznaczaniu strefy oddziaływania oczyszczalni na środowisko.

  • dla kompostowni - dobrym wskaźnikiem oddziaływania na otoczenie jest pospolity w kompoście grzyb pleśniowy - kropidlak popielaty (Aspergillus fumigatus).

  • dla składowisk odpadów - dobrymi mikroorganizmami wskaźnikowymi są grzyby ciepłolubne (rosnące w temp. 37oC) i keratynolityczne (rozkładające keratynę).


  1. Na czym polega mikrobiologiczna ocena stanu sanitarnego powietrza?

Ocena stanu sanitarnego powietrza obejmuje aspekt ilościowy i jakościowy, i zależy od rodzaju ocenianego powietrza. Inne kryteria stosuje się do powietrza atmosferycznego, a inne do powietrza wewnątrz różnego typu pomieszczeń. Wartości bezpiecznych stężeń podawane przez różnych autorów różnią się.

Według norm przyjętych w Polsce powietrze atmosferyczne jest czyste, jeśli zagęszczenie komórek bakterii mezofilnych nie przekracza 1000 jtk/m3, a grzybów mikroskopowych 3000 jtk/m3.

Wewnątrz pomieszczeń mieszkalnych ogólna liczba bakterii mezofilnych nie powinna przekraczać 2000 jtk/m3, a grzybów 300 jtk/m3.

Jeśli zagęszczenie mikroorganizmów przekracza podane wartości, lub w skład aerozolu wchodzą drobnoustroje niebezpieczne dla człowieka, to takie powietrze uważa się za zanieczyszczone mikrobiologicznie.

Dla pomieszczeń użytkowych dopuszczalne wartości graniczne zależą od ich przeznaczenia, np. na sali operacyjnej nie może być w ogóle grzybów a liczba bakterii nie może przekraczać 100 cfu/m3. Natomiast np. w chlewni dopuszcza się stężenie bakterii wynoszące 200000 cfu/m3, a grzybów 10000 cfu/m3.

Bardzo ważna z higienicznego punktu widzenia jest znajomość wielkości frakcji respirabilnej bioaerozolu. Im większy jest jej udział procentowy, tym większe zagrożenie dla zdrowia stwarza powietrze, nawet jeśli nie ma w nim mikroorganizmów wywołujących choroby zakaźne. Wdychanie takiego powietrza może bowiem być powodem alergii, zatruć i pylic.

Badania jakościowe z konieczności muszą być ograniczone do mikroorganizmów wskaźnikowych, bowiem identyfikacja drobnoustrojów chorobotwórczych jest zwykle żmudna i droga. Gatunki wskaźnikowe same nie muszą być chorobotwórcze, ale ich występowanie wskazuje pośrednio na potencjalne zagrożenie mikroorganizmami patogennymi.


  1. Na czym polega biofiltracja gazów i kiedy może być stosowana?

Biologiczne oczyszczanie powietrza w biofiltrach polega na powolnym przepuszczaniu gazów przez warstwę materiału porowatego zasiedlonego przez mikroorganizmy. W określonych warunkach pracy biofiltra, zanieczyszczenia obecne w gazie wylotowym są absorbowane i ulegają stopniowemu rozkładowi na naturalne substancje takie jak woda i dwutlenek węgla. Początkowo zanieczyszczone powietrze jest poddane wstępnemu oczyszczaniu w zintegrowanym z biofiltrem wstępnym skruberze, gdzie zostają zapewnienie optymalne warunki niezbędne dla dalszego procesu oczyszczania powietrza. W wstępnym skruberze zanieczyszczony gaz zostaje ochłodzony do odpowiedniej temperatury, odpowiednio nawilżony oraz pozbawiony stałych cząsteczek. Wstępny skruber pełni również rolę buforudla pojawiających się w powietrzu wysokich stężeń zanieczyszczeń. Wstępnie przygotowane powietrze rozprowadzane jest w kanale dystrybucyjnym a następnie przepływa z małą prędkością przez biologiczne złoże organiczne. Jako materiał filtrujący najczęściej stosuje się mieszaniny surowców pochodzenia organicznego, zawierające duży ładunek biomasy. Sposób ułożenia materiału filtrującego powinien zapewniać jego równomierne napowietrzenie i gwarantować kontakt całego strumienia gazu ze złożem. W celu zapewnienia odpowiednich warunków pracy biofiltra jest konieczne, aby materiał organiczny posiadał jednolitą strukturę oraz wystarczającą wilgotność. Zastosowanie biofiltrów jako efektywnego procesu oczyszczania powietrza ma miejsce głownie w miejskich i przemysłowych oczyszczalniach ścieków, instalacjach suszenia osadów, przemyśle spożywczym i produkcyjnym żywności, cukrowniach, rzeźniach, przemyśle przetwórstwa mięsnego i rybnego, fermach hodowlanych, kompostowniach i wysypiskach śmieci, przemyśle chemicznym, lakierniach oraz wielu innych procesach technologicznych. Wiele związków organicznych takich jak fenole, formaldehyd, ksylen, toluen, styren, alkohole, ketony i glikole ulegają efektywnemu rozkładowi. Przy zachowaniu optymalnych parametrów pracy likwidacja zanieczyszczeń jest bardzo wysoka i wynosi 98%.

  1. Podaj kryteria gatunku i omów zasady nazewnictwa prokariotów.

Kuliste:
-ziarniaki(Coccus)
-dwoinki(Diplococcus)
-paciorkowce(Strepotococcus)
-gronkowce(Staphylococcus)
-pakietowce(Sarcina)
Wydłużone, cylindryczne:
-laseczki(Bacillus)
-pałeczki(Bacterium)
-maczugowce(Corynebacterium)
Skręcone spiralnie:
-przecinkowce(Vibrio)
-śrubowce(Spirillum)
-krętki(Spirochaeta)
Rozgałęzione:
-prątki(Mycobacterium)
-promieniowce(Actinomyces)

Kryteria gatunku : reakcja Gram (dodatnie lub ujemne), tolerancja na temperaturę (mezofile i psychrofile), morfologia


  1. Porównaj 3 domeny organizmów.




















  1. Na czym polega taksonomia naturalna i jakie grupy bakterii wyróżnia się na jej podstawie?

Taksonomia naturalna (filogenetyczna)-połączenie spokrewnionych ze sobą form mających wspólnych przodków i uporządkowanie ich w jedno wspólne drzewo filogenetycznie bakterii. Te same właściwości biochemiczne (sekwencje aminokwasów w enzymach spełniających podobne funkcje)odznaczają się konserwatywną budową taką jak rybosomowe kwasy nukleinowe.

FILOGENETYCZNE GRUPY BAKTERII

Na podstawie sekwencji 16S rRNA wyróżnia się 12 głównych linii bakterii:

Aguifex - Hydrogenobacter: hipertermofilne chemolitotrofy utleniające H

2 lub redukujące związki siarki, żyją w temperaturze do 95°C

Thermotoga: hipertermofile, większość gatunków jest chemoorganotroficzna, z reguły o

beztlenowym metabolizmie fermentacyjnym

Zielone bakterie niesiarkowe (grupa Chloroflexus) - większość to fototrofy.

Deinococcus (wiele gatunków wyjątkowo odpornych na promieniowanie) oraz

termofile, przedstawiciel: Thermus aquaticus

Krętki (spirochetes)

Zielone bakterie siarkowe (fototrofy)

Bacteroides

- Flavobakterie:

mieszane typy fizjologiczne od bezwzględnych

beztlenowców (Bacteroides) do bezwzględnych tlenowców (Sporocytophaga) przez

względnie tlenowe.

Grupa Planctomyces - Pirella; reprodukcja przez pączkowanie, brak peptydoglikanu w

ścianie komórkowej.

Chlamydie i Mykoplazmy:

brak

ściany

komórkowej,

obligatoryjne,

wewnątrzkomórkowe pasożyty komórek zwierzęcych.

Bakterie Gram-dodatnie

- o niskiej zawartości GC

- o wysokiej zawartości GC

Sinice

Bakterie purpurowe (Protobakterie): największa i najbardziej zróżnicowana grupa

prokariontów


  1. Na czym polega taksonomia sztuczna i numeryczna?

Taksonomia sztuczna -jej celem jest grupowanie organizmów zgodnie z ich podobieństwem, tak aby mogłabyć klasyfikowana i oznaczona. W tym systemie posługujemy się kluczem który zawiera nazwy,opisy cech morfologicznych, fizjologicznych.

Taksonomia numeryczna -systematyczne uszeregowanie bakterii. Opiera się na zasadzie Adansona wg którego wszystkie uchwytne cechy organizmu są w klasyfikacji jednakowo ważne. Należy brać pod uwagę możliwie jak najwięcej cech, które ocenia się na + lub -.Oceny odpowiednich kombinacji cech można dokonać za pomocą komputera,każdą cechę danego szczepu porównuje się z tą samą cechą wszystkich pozostałych szczepów.


  1. Omów replikację DNA u mikroorganizmów prokariotycznych i eukariotycznych.

Replikacja DNA to proces, w którym podwójna nić DNA ulega skopiowaniu. Replikacja jest semikonserwatywna - w każdej z dwóch uzyskanych podwójnych nici DNA będzie jedna nić macierzysta i jedna nowa.

Substratami tego procesu są: DNA i trifosforany nukleozydów. W procesie tym bierze udział wiele enzymów, w tym: helikaza - tnie wiązania wodorowe między niciami DNA umożliwiając rozpoczęcie kopiowania primaza - syntetyzuje primer (starter) - krótki fragment z RNA umożliwiający rozpoczęcie procesu polimeraza DNA - z trifosforanów nukleozydów syntetyzuje (dobudowuje na zasadzie komplementacji) brakujące nici DNA egzonukleaza - usuwa primery RNA z nici, bez niej nowa nić zawierałaby zarówno DNA jak i niewielkie ilości RNA.

ligaza DNA - uzupełnia brakujące wiązania fosfodiestrowe w szkielecie nowo-zsyntezowanej nici DNA różne enzymy pomocnicze


Zasady replikacji są podobne u wszystkich organizmów, przy czym największe różnice występują między bakteriami z jednej strony, a prokariotami i eukariontami z drugiej.

U bakterii replikacja zaczyna się w ustalonym miejscu i postępuje bardzo szybko, z prędkością rzędu 1000 nukleotydów na sekundę.

U eukariotów replikacja jest o wiele wolniejsza, ok. 50 nukleotydów na sekundę, jednak zachodzi równocześnie w wielu miejscach. Polimeraza DNA działa jedynie w kierunku od końca 3' do końca 5'. Z tego powodu jedna z nici jest syntezowana w sposób ciągły, druga (ta, którą chcielibyśmy zsyntezować w przeciwną stronę) fragmentami.

Przebieg replikacji DNA

W punktach

1) Dwie nici podwójnej helisy w pewnym miejscu rozplatają się; powoduje to rozerwanie par zasad komplementarnych

  1. W pobliżu miejsca rozplecenia zawsze znajduje się dostateczna ilość wolnych nukleotydów; do każdej z zasad w rozplecionych niciach dołącza zasada komplementarna, stanowiąca część wolnego nukleotydu - jednostki budulcowej DNA

  2. Między nowo dołączonymi nukleotydami powstają trwałe połączenia - w ten sposób tworzy się nowa nić DNA.

Szczegóły procesu

Kopiowanie podwójnej helisy DNA jest procesem złożonym. Rozpoczyna się w miejscu inicjacji, liczącym ok. 200-300 par nukleotydów. Aby replikacja przebiegła prawidłowo, rozdzielenie obu nici musi zajść bez zniszczenia ich struktury podstawowej (I-rzędowej) i w odpowiednich warunkach, jak: dokładne odczytanie matrycy DNA, obecność odpowiedniej liczby wolnych nukleotydów, zachowania komplementarności. Na koniec musi dojść do terminacji replikacji, ewentualnego uzupełnienia braków na końcu nowopowstałej cząsteczki i połączenia nowych cząsteczek w helisę.

U bakterii zakończenie replikacji jest niemal automatyczne (po skopiowaniu całego kolistego DNA , który jest pojedynczym replikonem.

U eukariotów miejsc replikacji (replikonów) jest wiele, a jej terminacja zachodzi po zakończeniu wielu procesów replikacyjnych zachodzących niemal jednocześnie w różnych miejscach replikujących cząsteczek DNA. Do terminacji dochodzi, gdy widełki replikacyjne replikonu natkną się na specjalną sekwencję terminacyjną. Proces replikacji nie-kolistych (eukariotycznych) cząsteczek DNA wiąże się z problemem wolnych zakończeń powstających cząsteczek DNA. Zakończenia te, zwane telomerami składają sie z krótkich, ale wielokrotnie powtórzonych sekwencji. Replikazy wydłużają jedynie istniejące już nici, nie są natomiast w stanie zsyntetyzować końcowych odcinków telomerów. W rezultacie odcinki te narażone są na regularne skracanie. Skracaniu temu zapobiega obecność telomerazy, która przeprowadza odwrotną transkrypcję tych odcinków, posługując się jako "matrycą" nie DNA, ale RNA, będącym częścią składową tego enzymu. Zapobiega to odsłonięciu znaczących fragmentów DNA.

Różnice między grupami organizmów

Między replikacją u bakterii oraz prokariotów i eukariotów (które prawie zawsze mają wspólne mechanizmy przetwarzania informacji) zachodzą dość duże różnice. Nie wszystkie enzymy uczestniczące w replikacji DNA są uważane za homologiczne, co może sugerować, że ostatni uniwersalny wspólny przodek miał jedynie częściowo wykształcony proces replikacji DNA.


  1. Omów transkrypcję u mikroorganizmów eukariotycznych i prokariotycznych.


  1. Omów translację u mikroorganizmów eukariotycznych i prokariotycznych.



  1. Wymień znane rodzaje mutacji i omów sposób ich powstawania.



  1. Wyjaśnij mutagenne działanie promieniowania UV.

Światło ultrafioletowe działa na mikroorganizmy zarówno letalnie, jak i mutagennie. Mechanizm tego działania nie został jeszcze w pełni poznany. Znaczna współzależność między widmem absorbowanym przez kwasy nukleinowe a widmem mającym efekt letalny i mutagenny sugeruje, że to właśnie kwas nukleinowy jest celem ataku przez UV. Blisko ultrafiolet, około 260 nm, jest najbardziej aktywny. Toksyczne działania uboczne prawie nie występują. UV niszczy głównie zasady pirymidynowe. Dwie tyminy sąsiadujące ze sobą zostają połączone wiązaniami kowalencyjnymi. Takie dimery tyminowe mogą następnie powodować błędy repikacyjne. Fotodimery pirymidyn powodują zahamowanie włączania nukleotydów w procesie replikacji prze polimerazę DNA III co powoduje fragmentację DNA i efekt letalny.

Odkrycie zdolności do naprawy przynajmniej części uszkodzeń DNA jest związane z działaniem promieni UV na bakterie. Po naświetleniu zawiesiny bakteryjnej dużą dawką UV i następnie inkubacji w ciemności, tylko mały odsetek komórek zachowuje zdolność do tworzenia kolonii. Przeciwnie, jeżeli bakterie po naświetlaniu UV poddamy działaniu światła o dłuższych falach, procent przeżywających komórek wzrasta o kilka rzędów wielkości. Ta fotoreaktywacja zachodzi z udziałem enzymu fotoliazy, który czerpiąc energię ze światła o dłuższych falach, rozszczepia dimery tyminy na monomery. W ten sposób następuje powrót do stanu wyjściowego, a naprawa jest bezbłędna.

Drugi, równie bezbłędny sposób naprawy uszkodzeń powodowanych promieniowaniem nie wymaga światła. Ta ciemna reaktywacja polega na wycięciu uszkodzonego kawałka nici DNA i zastąpieniu go nowymi nukleotydami.

Skuteczność naprawy uszkodzeń radiacyjnych zależy od szczepu bakterii.


  1. Wyjaśnij zjawisko rewersji mutacji.

Mutacje powrotne albo rewersje: Wiele mutantów, choć nie wszystkie, może mutować wstecznie, z przywróceniem cech dzikiego rodzica. Odróżnia się dwa rodzaje mutacji pierwotnych:

1)rewertanty (prawdziwe), gdy druga mutacja w tym samym genie odtwarza genotyp pierwotny, tj. genotyp typu dzikiego istniejący zanim zaszła pierwsza z mutacji

2)rewertanty funkcjonalne z zachowaną oryginalną mutacją, lecz fenotypowo dzikie w wyniku powstania drugiej mutacji w innym locus (określony obszar chromosomu zajmowany przez gen) w obrębie tego samego lub nawet innego genu. Do grupy tej należą mutanty supresorowe, w których nowa mutacja hamuje w sposób pośredni początkowy defekt. Mutanty supresorowe niejednokrotnie rosną wolniej niż prawdziwy typ dziki. Podstawą wolniejszego wzrostu jest zachodzące od czasu do czasu włączanie złego aminokwasu wskutek możliwości wykorzystania kilku pokrewnych tRNA przez jeden aminokwas.


  1. Omów proces rekombinacji.

Rekombinacja jest to proces wymiany materiału genetycznego, w wyniku którego powstają nowe genotypy. Zgodnie z obecnym stanem wiedzy, istnieją dwa różne mechanizmy, za pomocą których obcy DNA pobrany przez komórkę bakteryjną może zostać włączony do chromosomu lub plazmidu, są to:

  1. rekombinacja ogólna lub homologiczna

  2. rekombinacja zależna od miejsca lub sekwencji, zwana również rekombinacją zlokalizowaną

-Rekombinacja ogólna lub homologiczna-terminem tym określamy proces, w którym obcy DNA znajdujący się w komórce zostaje włączony do DNA gospodarza przez połączenie się w pary homologicznych sekwencji, pęknięcie i krzyżową wymianę (crossing-over). Wzajemna wymiana odcinków DNA między chromosomami dawcy i biorcy rozpoczyna się równoległym ułożeniem (sparowaniem) homologicznych odcinków i jednoniciowym pęknięciem. Następnym etapem jest wymiana jednoniciowych segmentów DNA dawcy i biorcy. W procesie tym bierze udział białko RecA i białko wiążące jednoniciowy DNA. Efekt rekombinacji ujawnia się dopiero w komórkach potomnych. Warunkiem koniecznym tego procesu jest istnienie długiego obszaru homologii sekwencji w DNA dwóch partnerów. Wiadomo jednak, że niewielkie różnice sekwencji, na przykład powstałe w wyniku mutacji, bywają tolerowane. Homologiczna rekombinacja może więc zachodzić między DNA dzikiego typu i DNA mutanta. Rekombinacje ogólną katalizuje co najmniej 6 enzymów mających również znaczenie w reparacji DNA. Najważniejszym z nich jest wspomniany wcześniej RecA.

-Rekombinacja zależna od określonego miejsca lub sekwencji-ten rodzaj rekombinacji, w przeciwieństwie do rekombinacji ogólnej, wymaga jedynie krótkiego odcinka homologii DNA koniecznej do rozpoznania się partnerów. Rekombinacja ta nie jest katalizowana przez białko RecA, lecz przez enzymy swoiste dla rekombinujących cząsteczek DNA. Jeśli sekwencja wymagana do rozpoznania znajduje się w dwóch partnerach mamy do czynienia z „rekombinacją określoną przez dwa miejsca”. Przykładem tego typu rekombinacji jest integracja (włączenie) bakteriofaga lambda i plazmidu płciowego F do chromosomu E.coli. Obecność rozpoznawanej sekwencji tylko w jednej cząsteczce DNA prowadzi do rekombinacji „określonej przez jedno miejsce”, która jest związana z ruchomymi elementami genetycznymi, jak sekwencje insercyjne, transpozony, bakteriofag Mu.

Jak wykazały doświadczenia genetyczne, przejście faga lamba w stadium profaga jest związane z jego integracją w określone miejsce chromosomu E.coli, między operonami gal i bio. Kolisty chromosom faga wiąże się przy pomocy białek w określonym miejscu attP do miejsca attB chromosomu gospodarza znajdującego się między genami bio i gal. Następnie chromosom faga zostaje zintegrowany przez pęknięcie i ponowne wzajemne połączenie dwóch nici. Prowadzi to do integracji fagowego DNA z DNA gospodarza.


  1. Co to są plazmidy i jakie pełnią funkcje?

Plazmid - cząsteczka DNA występująca w komórce poza chromosomem i zdolna do autonomicznej (niezależnej) replikacji. Plazmidy występują przede wszystkim u prokariotów, ale znane są także nieliczne plazmidy występujące u eukariotów. Zazwyczaj plazmidy nie niosą genów metabolizmu podstawowego, a więc nie są komórce niezbędne do przeżycia. Mogą jednak kodować produkty potrzebne w pewnych specyficznych warunkach, na przykład geny oporności na antybiotyki lub umożliwiające rozkład i asymilację różnych związków odżywczych. Plazmidy w drodze koniugacji mogą być przekazywane pomiędzy komórkami bakteryjnymi.


  1. Omów mechanizmy przenoszenia materiału genetycznego u bakterii.

Bakterie posiadają zwykle pojedynczy chromosom, którego wielkość wynosi zaledwie od około 16 000 par zasad u endosymbiotycznych Candidatus Carsonella ruddii[78] do 12 000 000 par u Sorangium cellulosum[79]. Krętki z rodzaju Borrelia są jedynym wyjątkiem, gdyż mają pojedynczy chromosom o kształcie lini. Należy tu Borrelia burgdorferi, który wywołuje boreliozę, zwaną także krętkowicą kleszczową oraz chorobą z Lyme[80]. Bakteryjne geny zwykle są umieszczone na pojedynczym odcinku DNA i chociaż u bakterii zdarzają się także różne typy intronów, to są one o wiele rzadsze niż u eukariontów[81]. Bakterie mogą także posiadać plazmidy, które są dodatkowymi, małymi chromosomami. Zawierają one DNA odpowiadające między innymi za oporność na antybiotyki, oraz czynniki decydujące o wirulencji patogenu.

Bakterie potrafią także wymieniać się genami między sobą. Zjawisko to może nastąpić na trzy różne sposoby. Po pierwsze bakterie mogą pobrać dany gen z środowiska w procesie nazywanym transformacją. Drugą metodą jest przeniesienie genów w procesie transdukcji, kiedy bakteriofag wprowadza swoje geny do chromosomu. Trzecią możliwość stanowi koniugacja bakteryjna, gdzie DNA jest przenoszone poprzez bezpośredni kontakt komórek bakterii.

Jednym z typów bakteryjnego genomu jest połączenie genów bakterii z materiałem genetycznym bakteriofagów. Wiele bakterii jest atakowanych przez te wirusy, które "wstrzykują" do ich chromosomów własny materiał genetyczny. Bakteriofagowe geny mają wielki wpływ na fenotyp bakterii. Dzięki temu na drodze ewolucji niegroźne bakterie zamieniały się w niebezpieczne dla życia innych organizmów, takie jak Escherichia coli O157:H7 czy Clostridium botulinum po przejęciu niesionych przez faga genów pewnej toksyny[82]. Bakterie potrafią jednak bronić się przed zainfekowaniem przez fagi. Służy im do tego specjalny system obronny nazywany systemem ograniczenia modyfikacji, który potrafi degradować obce DNA i rozbijać je na pojedyncze nukleotydy[83]. System ten używa także odpowiednich kolejności CRISPR, dzięki któremu może zapamiętywać szczególne cechy danego bakteriofaga i w późniejszym kontakcie z nim znacznie lepiej go zwalczać, poprzez blokowanie syntezy materiału genetycznego faga i bakterii oraz dalszemu uniemożliwieniu przeprowadzenia intenferencji RNA[84][85]. CRISPR stanowi więc odporność nabytą bakterii na infekcje wirusową.

Bakterie jako organizmy rozmnażające się bezpłciowo dziedziczą identyczny materiał genetyczny od ich rodziców (można nawet powiedzieć, że są ich klonami). Mimo to każda bakteria kształtuje swój własny fenotyp, co jest spowodowane zmianami w DNA. Poza tym wśród bakterii można sztucznie spowodować zmianę. Naturalnie może ona powstać na skutek mutacji oraz rekombinacji genetycznej. Mutacje powstają na skutek błędów w czasie tworzenia repliki DNA lub jako skutek oddziaływania mutagenu. Szansa na powstanie i czas potrzebny do zajścia mutacji są różne w obrębie każdego gatunku, a nawet tej samej bakterii[86]. Genetyczne zmiany u bakterii są powodowane mutacjami przy replikacji genów albo na skutek różnorodnych "nacisków" ze strony człowieka, gdy na wybrany gen oddziałuje się licznymi mutagenami, prowadzi to do zakłócenia procesów wewnętrznych i w konsekwencji do mutacji[87].

Podczas koniugacji jedna komórka („dawca”) wytwarza rurkowate cytoplazmatyczne wyrostki, tzw. pilusy, umożliwiające kontakt między komórkami bakterii. Po wymianie cytoplazmy wraz z materiałem genetycznym (plazmidami) komórki rozdzielają się. Proces ten ma różne odmiany. Wszystkie sposoby wymiany materiału genetycznego nazywają się poziomym transferem genów. Bakterie mogą wykorzystywać wszystkie te metody w naturalnym środowisku[88]. Transfer genowy jest szczególnie cenny przy wytwarzaniu oporności na antybiotyki, gdyż umożliwia bakterii odpornej na działanie antybiotyku uodparnianie innych, poprzez przekazywanie im genów warunkujących odporność, przez co może doprowadzić do uodpornienia całej populacji[89]. Z tego powodu poziomy transfer genów może być z medycznego punktu widzenia niezwykle groźny, gdy zachodzi wśród bakterii chorobotwórczych. Odkrycie poziomego transferu genów (transformacji u dwoinki zapalenia płuc) przez Fredericka Griffitha przyczyniło się do rozwoju genetyki molekularnej i później pozwoliło wyjaśnić rolę DNA.


  1. Wyjaśnij działania operonu.

Operon laktozowy Escherichia Coli jako przykład regulacji ekspresji genu u Procaryota
1. Operon jest to grupa kilku genów, które są wspólnie regulowane. Białka kodowane przez geny operonu są enzymami katalizującymi w komórce kilka, następujących po sobie reakcji chemicznych (tzw. ciąg metaboliczny).
Geny operonu leżą tuż obok siebie, dzięki temu komórka może "uruchomić" je wszystkie "za jednym zamachem" kiedy będą potrzebne - tzn. gdy "opłaca się" przeprowadzenie danego ciągu reakcji. Geny operonu, nazywane również genami struktury, są przepisywane na wspólny mRNA, powstaje jeden długi transkrypt, zawierający informacje o kilku białkach. Transkrypt ten ulega zaraz translacji; sekwencje kodujące białka rozdzielone są sygnałami startowymi i końcowymi dla translacji, dlatego w wyniku tego procesu powstaje od razu kilka osobnych białek . Wspólny transkrypt dla kilku genów kontrolujących dany ciąg reakcji - tak w jednym zdaniu można określić istotę operonu.
Operony wykryto dotychczas wyłącznie u organizmów prokariotycznych; taki sposób regulacji ekspresji kilku genów prawdopodobnie w ogóle nie występuje u organizmów eukariotycznych ze względu na inną budowę genów (są długie i zawierają introny) oraz przestrzenny i czasowy rozdział transkrypcji i translacji. Prokariotyczne mRNA ulega translacji jeszcze podczas trwania transkrypcji, natomiast u organizmów eukariotycznych z pierwotnego tanskryptu usuwane są introny, po czym powstały mRNA wędruje przez pory w błonie jądrowej do cytoplazmy. Długi transkrypt zawierający informacje o kilku białkach prawdopodobnie nie miałby szans na przeżycie w komórce eukariotycznej, uległby zniszczeniu jeszcze na terenie jądra komórkowego, podczas wycinania intronów lub podczas wędrówki z jądra do cytoplazmy.
2. Operon laktozowy występuje u bakterii Escherichia coli. Funkcjonowanie tego operonu zostało wyjaśnione w 1961 roku przez dwóch francuskich uczonych, Francoisa Jacoba i Jacuesa Monoda. Operon laktozowy zawiera trzy geny, kodujące białka związane z metabolizmem laktozy. Pierwsze z nich, permeaza, jest odpowiedzialne za transport cząsteczki laktozy do wnętrza komórki bakterii. Kolejne białko, b-galaktozydaza, rozcina cząsteczkę tego dwucukru na glukozę i galaktozę. Trzecie białko, tansacetylaza, uczestniczy również w metabolizmie laktozy. Wszystkie te białka są potrzebne komórce bakteryjnej tylko wtedy, gdy w jej otoczeniu znajduje się laktoza, zaś innych wydajniejszych żródeł energii (np. glukozy) brak.
3. Operon laktozowy jest regulowany na dwa sposoby; negatywnie i pozytywnie. Regulacja negatywna polega na stałym (czyli konstytutywnym) blokowaniu transkrypcji kiedy w otoczeniu komórki bakteryjnej nie ma laktozy. Regulacja negatywna jest zabezpieczeniem przed produkcją enzymów, które nie są potrzebne komórce, gdy nie ma substratu (laktozy).
Regulacja pozytywna polega na aktywowaniu transkrypcji przez związki, które umożliwiają przyłączenie się polimerazy RNA; zachodzi gdy w otoczeniu bakterii pojawia się laktoza, ale brak glukozy. Glukoza jest bardziej ekonomicznym żródłem węgla, niż laktoza, ponieważ laktoza musi być rozcięta na cukry proste, nim wejdzie w proces glikolizy, a to wymaga energii. Dlatego komórce, która ma do wyboru glukozę i laktozę nie opłaca się "zjadać" laktozy - w takiej sytuacji geny operonu laktozowego nie ulegają włączeniu, mimo obecności laktozy.
Regulacja ekspresji genów operonu laktozowego jest możliwa dzięki odcinkom znajdującym się przed sekwencją kodującą.Odcinki te to: promotor, czyli miejsce wiązania polimerazy RNA, katalizującej transkrypcję oraz operator. Operator jest to krótka sekwencja nukleotydów, znajdująca się tuż przed pierwszym genem struktury.
4. Regulacja negatywna operonu laktozowego. Do sekwencji operatora może przyłączyć się tzw. represor, białko, które blokuje transkrypcję genów struktury, ponieważ jest tak duże, że przyłączone do operatora, zasłania promotor i uniemożliwia przyłączenie się do niego polimerazy RNA.
Gen kodujący represor, czyli tzw. gen regulatorowy, nie należy do operonu laktozowego, znajduje się w innej częsci bakteryjnego genomu, daleko - bo aż kilka tysiecy par zasad od operatora. Gen kodujący represor jest genem konstytutywnym, oznacza to, że ulega on stale ekspresji i niewielka ilość represora zawsze znajduje się w komórce. Represor dociera do operatora na zasadzie dyfuzji i łącząc się z nim blokuje ekspresję genów operonu.
Represor operonu laktozowego jest białkiem allosterycznym - to znaczy takim, które może zmieniać swoją strukturę przestrzenną (konformację) pod wpływem przyłączanych czynników regulacyjnych. Takim czynnikiem może być pochodna laktozy - allolaktoza. Jeżeli w otoczeniu komórki bakteryjnej pojawi się laktoza, niektóre jej cząsteczki zostaną przetransportowane do wnętrza komórki i przetworzone na allolaktozę. Allolaktoza przyłącza się do represora i to doprowadza do takiej zmiany konformacji represora, że nie może on rozpoznać sekwencji operatora i specyficznie się z nią połączyć. Represor przestaje blokować transkrypcję genów struktury.
Laktoza jest w tym wypadku induktorem transkrypcji, pod jej wpływem zablokowane przez represor geny struktury ulegają "włączeniu" (indukcji) ich ekspresja wzrasta tysiąckrotnie; poziom b-galaktozydazy , enzymu odpowiedzialnego za rozcinanie laktozy, znikomy przed indukcją, wzrasta do trzech tysięcy cząsteczek w komórce, co stanowi ok.3% białek komórki Escherichia coli.
5. Regulacja pozytywna operonu laktozowego jest niezbędna, by zaszła transkrypcja. W pobliżu promotora operonu laktozowego znajduje się sekwencja nukleotydów, do której przyłącza się białko aktywujące transkrypcję - tzw. białko CAP - białkowy aktywator katabolizmu (spalanie laktozy jest procesem katabolicznym). Bez tego białka polimeraza RNA ma słabe powinowactwo do promotora i transkrypcja nie zachodzi, nawet w obecności laktozy, przy odblokowanym operatorze.
Białko CAP jest dimerem (tzn. składa się z dwóch podjednostek), podobnie jak represor ma zdolność do zmiany konformacji pod wpływem przyłączenia czynników regulacyjnych. Białko CAP przyjmuje aktywną postać po przyłączeniu cAMP - cyklicznego adenozynomonofosforanu i dopiero wtedy może przyłączyć się do DNA( cAMP reguluje aktywność wielu ważnych dla komórki białek, obrazuje to laboratoryjne powiedzonko: "jeżeli wszystko zawodzi, sprawdź poziom cAMP"). Poziom cAMP jest związany z ilością glukozy w komórce - im mniej glukozy, tym więcej cAMP. Tak więc białko CAP jest aktywne przy niskim stężeniu glukozy.
Dzięki takiej precyzyjnej regulacji operon laktozowy jest uruchamiany tylko w obecności laktozy i przy niskim stężeniu glukozy.


  1. Wyjaśnij proces represji katabolicznej.

Represja kataboliczna - polega na zahamowaniu ekspresji genów kodujących białko enzymatyczne, katalizujące rozkład substancji pokarmowych, na skutek wzrostu dostępności innego substratu, którego katabolizm jest bardziej wydajny energetycznie. Przykładem jest zahamowanie genów operonu laktozowego u pałeczki okrężnicy w obecności glukozy w pożywce.

Mechanizm represji katabolicznej opiera się na fakcie, że polimeraza RNA łączy się z promotorem w operonie lac dużo lepiej w obecności specyficznego białka CAP (catabolite gene activator protein), które musi być związane ze specyficznym miejscem DNA położonym w pobliżu tzw.CBS (CAP binding site). Białko CAP wiąże się z tym miejscem jeśli do tego białka przyłączą się cząsteczki cAMP, co zachodzi przy braku glukozy.







mikro 013.jpg

Plik dostępny po zalogowaniu.

Kołowzan, Adamiak, Grabas, Pawełczyk - Podstawy Mikrobiologii W Ochronie Środowiska.pdf

Podgląd pliku (pełna wersja wyższej jakości po zalogowaniu):


PODSTAWY MlKRoBloLoGu w ocHRoNlE śRoDowlsKA

BARBARA KOŁWZAN WALDEMAR ADAMIAK KAZIMIERZ GRABAS ADAM PAWEŁCZYK



Recenzenci Andrzej Noworyta Zdzisław Szulc

Publikacja przygotowana na podstawie dostarczonych materiałów

© Copyright by Oficyna Wydawnicza Politechniki Wrocławskiej, Wrocław 2005

ISBN 83-7085-879-1

Oficyna Wydawnicza Politechniki Wrocławskiej Wybrzeże Wyspiańskiego 27, 53-370 Wrocław http://www.pwr.wroc.pl/~oficwyd oficwyd@pwr.wroc.pl



PODSTAWY MIKROBIOLOGII W OCHRONIE ŚRODOWISKA

Książka PODSTAWY MIKROBIOLOGII W OCHRONIE ŚRODOWISKA została napisana przez naukowców z Politechniki Wrocławskiej uczestniczących wraz z partnerami z Belgii, Irlandii, Bułgarii, Portugalii i Holandii w międzynarodowym projekcie Socrates Minerva CELL TALK–88091–CP-BE-2000-Minerva-ODL. Koordynatorem projektu był prof. Chris van Keer z Katholieke Hogeschool Sint Lieven w Gandawie. Książka jest adresowana do studentów inżynierii środowiska, biologii, biotechnologii, biochemii oraz do studentów innych specjalizacji zainteresowanych uzupełnieniem swojej wiedzy na temat mikroorganizmów występujących w środowisku naturalnym oraz mikroorganizmów zdolnych do degradacji ksenobiotyków.

Autorzy

Barbara Kołwzan absolwentka wydziału towaroznawstwa Akademii Ekonomicznej w Poznaniu. Tytuł doktora nauk technicznych uzyskała na Politechnice Wrocławskiej. Pracowała w laboratorium toksykologicznym jako asystent naukowy a obecnie jest kierownikiem Zakładu Biologii i Ekologii Instytutu Inżynierii Ochrony Środowiska Politechniki Wrocławskiej. Zajmuje się bioindykacją i biodegradacją zanieczyszczeń środowiskowych oraz bioremediacją gruntów skażonych ksenobiotykami. barbara.kolwzan@pwr.wroc.pl



Waldemar Adamiak Ukończył biologię na Wydziale Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu Wrocławskiego (1984). Obecnie jest wykładowcą na Wydziale Inżynierii Środowiska Politechniki Wrocławskiej. Zajmuje się biologicznym oczyszczaniem gazów, mikrobiologią powietrza i badaniem mutagenności zanieczyszczeń pyłowych. waldemar.adamiak@pwr.wroc.pl

Kazimierz Grabas doktor nauk technicznych – absolwent Wydziału Chemicznego Politechniki Wrocławskiej. Aktualnie jest zatrudniony na etacie adiunkta w Instytucie Chemii i Technologii Nafty i Węgla. Jego działalność naukowa obejmuje: inżynierię i ochronę środowiska oraz technologię chemiczną. Brał udział i kierował projektami naukowo-badawczymi finansowanymi przez KBN, podmioty gospodarcze i samorządowe oraz w ramach programu Tempus i Socrates. kazimierz.grabas@pwr.wroc.pl

Adam Pawełczyk uzyskał stopień magistra inżyniera na Wydziale Chemicznym Politechniki Wrocławskiej i tytuł doktora nauk technicznych na tej samej uczelni. Pracuje na stanowisku adiunkta. Jego główne zainteresowania zawodowe to chemiczne i biochemiczne metody utylizacji odpadów organicznych i nieorganicznych, szczególnie biochemiczne przetwarzanie odpadów organicznych na nawozy mineralno-organiczne i inne użyteczne produkty. W ostatnim okresie realizuje projekty dotyczące zagrożeń środowiska i remediacji gruntów skażonych chemicznie. adam.pawelczyk@pwr.wroc.pl



Podziękowania

Autorzy wyrażają wdzięczność Pani mgr Marii Pawlik, mgr Agnieszce Trusz, Barbarze Umińskiej, mgr Henrykowi Małysie, dr Aleksandrze Obarze oraz dr Marcie Chyli za pomoc techniczną i współpracę naukową.



Spis treści

1. Mikrobiologia gleby 1.1. Gleba 1.2. Edafon 1.3. Czynniki edaficzne 1.4. Działalność mikroorganizmów w glebie 1.5. Formy współżycia 1.6. Bioremediacja

2. Mikrobiologia wody 2.1. Woda 2.2. Grupy organizmów wodnych 2.3. Czynniki limitujące rozwój mikroorganizmów w wodzie 2.4. Charakterystyka mikroorganizmów wodnych 2.5. Wody zanieczyszczone 2.6. Kryteria jakości zdrowotnej wody 2.7. Ścieki. Biologiczne metody oczyszczania ścieków

3. Mikrobiologia powietrza 3.1. Powietrze jako środowisko bytowania mikroorganizmów 3.2. Przystosowanie mikroorganizmów do przebywania w powietrzu 3.3. Aerozol biologiczny 3.4. Mechanizmy chroniące przed wnikaniem aerozoli do płuc 3.5. Przeżywalność i rozprzestrzenianie mikroorganizmów w powietrzu 3.6. Aerozol biologiczny jako źródło zagrożeń dla człowieka 3.7. Główne źródła emisji bioaerozolu 3.8. Badanie zanieczyszczeń mikrobiologicznych powietrza



1. Mikrobiologia gleby

Spis treści

1.1. Gleba 1.2. Edafon 1.3. Czynniki edaficzne 1.4. Działalność mikroorganizmów w glebie 1.5. Formy współżycia 1.6. Bioremediacja

Cele

Rozdział ten został przygotowany w celu zapoznania studenta z różnorodnością organizmów żyjących w glebie oraz z czynnikami fizycznymi, chemicznymi i biologicznymi limitującymi ich rozwój. Omówiono także formy współżycia występujące w obrębie biocenozy glebowej. Zawarte z nim informacje pozwolą zrozumieć rolę mikroorganizmów w środowisku glebowym. Podano także podstawowe informacje dotyczące możliwości remediacji skażonych gleb metodami biologicznymi.

Ukierunkowanie

W rozdziale tym na wstępie scharakteryzowano środowisko glebowe, mikroorganizmy je zamieszkujące oraz czynniki wpływające na ich aktywność i rozwój. Zwrócono także uwagę na relacje występujące między organizmami glebowymi.

Wymagana wiedza

Co wiesz o wirusach, bakteriach, grzybach, glonach i pierwotniakach? Jaka jest ich morfologia? Jeśli posiadane informacje nie są wystarczające zapoznaj się z poprzednimi rozdziałami. Konieczne jest także posiadanie wiedzy na temat metabolizmu mikroorganizmów. Dla przykładu co wiesz na temat reakcji katabolicznych przeprowadzanych przez mikroorganizmy?

Wskazówki i porady

Na wstępie przeczytaj cały rozdział. Zajrzyj do słowniczka by wyjaśnić znaczenie nieznanych pojęć. Jeśli w dalszym ciągu masz kłopoty ze zrozumieniem tekstu przeczytaj ponownie rozdziały omawiające budowę komórek mikroorganizmów oraz ich metabolizm.



1.1. Gleba

Co to jest gleba?

Gleba to powierzchniowa warstwa litosfery ziemskiej, utworzona z wietrzejącej skały, przekształconej w specyficzny sposób przez organizmy żywe

Czynniki glebotwórcze

Proces powstawania gleby począwszy od skały macierzystej, czyli jej podstawowego tworzywa, może mieć różny przebieg w zależności od panującego układu czynników glebotwórczych, takich jak:

● klimat,

● woda,

● organizmy żywe,

● ukształtowanie powierzchni,

● działalność człowieka i

● czas (wiek gleby).

Funkcje gleby

Gleba jest złożonym utworem umożliwiającym funkcjonowanie ekosystemów glebowych.

● Uczestniczy częściowo w produkcji pierwotnej biomasy oraz umożliwia zakotwiczenie roślin, dostarczając im wody oraz niezbędnych składników mineralnych.

● W glebie zachodzą procesy rozkładu materii organicznej i magazynowana jest próchnica.

● Ze względu na swój skład chemiczny oraz właściwości fizyczne gleba jest siedliskiem olbrzymiej ilości drobnoustrojów i innych żywych organizmów.

● Gleba spełnia w środowisku przyrodniczym różne funkcje filtrujące i buforujące, chroniące ekosystemy przed nadmiernym przepływem substancji niepożądanych dla innych elementów biosfery.

Skład gleby

W skład gleby wchodzą cząstki stałe mineralne i organiczne, powietrze i roztwór glebowy oraz bytujące w niej organizmy żywe - edafon. Proporcje poszczególnych składników w glebie utrzymują się mniej więcej na tym samym poziomie właściwym dla danej gleby (rys. 1.1).

Rys. 1.1. Przeciętny skład poszczególnych frakcji gleby: mineralnej (na lewo) i organicznej (na prawo)



Związki mineralne

● Występują w glebie w postaci cząstek różnej wielkości.

● Najdrobniejszą frakcję stanowią koloidy mineralne zbudowane z glinokrzemianów, uwodnionej krzemionki, wodorotlenków glinu i żelaza.

● Koloidy glebowe sorbują silnie tlen, wodę oraz ważne składniki pokarmowe i w związku z tym są także siedliskiem dla drobnoustrojów. Stanowią one składnik gleby decydujący o stosunkach wodno-powietrznych.

Substancje organiczne

● Substancję organiczną gleby tworzą resztki obumarłych roślin, zwierząt i mikroorganizmów, rozkładane przez zamieszkujące glebę mikroorganizmy.

● Rozkład substancji organicznej polega na szeregu procesach mikrobiologicznych i fizyczno-chemicznych zwanych humifikacją, a jego produktem są substancje humusowe (próchnica) będące częściowo w stanie koloidalnym.

● Koloidy organiczne są źródłem pokarmu dla drobnoustrojów. Ponadto w połączeniu z cząstkami ilastymi nadają glebie odpowiednią strukturę. Próchnica sprzyja wzrostowi roślin wyższych dzięki zdolności pochłaniania wody oraz adsorpcji i wymiany związków mineralnych.

Roztwór glebowy

Roztwór glebowy to woda wraz z rozpuszczonymi substancjami organicznymi i mineralnymi oraz gazami, zatrzymana dzięki siłom kapilarnym pomiędzy agregatami i grudkami gleby.

Skład chemiczny roztworów glebowych stale zmienia się, co m.in. zależy od wahań temperatury i ilości wody, która powoduje albo rozrzedzenie albo zagęszczenie roztworów w glebie, niemniej drobnoustroje mają w nich stale dostępne sole amonowe, fosforanowe, potasowe i azotany.

W roztworach glebowych znajdują się także łatwo przyswajalne związki organiczne np. cukry i aminokwasy.

Woda glebowa stwarza warunki sprzyjające życiu i rozwojowi organizmów (nie tylko mikroorganizmów, ale i roślin):

● jest przenośnikiem składników pokarmowych dla drobnoustrojów,

● transportuje substancje energetyczne i budulcowe wzdłuż kapilar,

● ma też wpływ na stan napowietrzenia, ilość i jakość składników pokarmowych, ciśnienie osmotyczne i pH roztworu glebowego.

Atmosfera gleby

● Atmosfera gleby, czyli powietrze glebowe wypełnia nie zajęte przez wodę przestrzenie gleby między stałymi cząstkami. Powietrze wysyca również koloidy glebowe.

● Ilość powietrza w glebach waha się od 8-35% objętości gleby. Występują w nim gazy: N

2

, O

2

i CO

2

; a przejściowo: NH

3

,H

2

,CO, formy NO

x

, SO

2

, H

2

S,CH

4

i C

2

H

6

oraz inne lotne substancje organiczne (kwas masłowy, alkohole, estry).

● Powietrze glebowe jest zwykle wysycone para wodną i zawiera 10 razy więcej CO

2 niż powietrze atmosferyczne.

● Zmiana metabolizmu z tlenowego na beztlenowy (redukcja siarczanów, denitryfikacja) zachodzi w glebie wtedy, gdy stężenie O

2

spadnie poniżej 1%. Rozwijają się wtedy mikroorganizmy beztlenowe, które mają zdolność wytwarzania energii i wzrostu w warunkach braku tlenu.

Edafon glebowy (rys. 1.2)

● Organizmy zasiedlające glebę tworzą złożony zespół o bardzo dużej liczebności zwany edafonem. Są to mikroorganizmy, grzyby, jednokomórkowce roślinne i zwierzęce, rośliny naczyniowe oraz bezkręgowce bytujące w przypowierzchniowej warstwie gleby.



● Mikroorganizmy glebowe dzięki swym różnorodnym właściwościom biochemicznym są niezbędnym gwarantem ciągłości przemiany materii w przyrodzie. Wynikiem ich działalności jest nie tylko mineralizacja związków organicznych, ale i przemiany związków mineralnych, mające duże znaczenie dla rozwoju roślin zielonych.

● Edafon może stanowić od 1 do 10% suchej masy substancji organicznej gleby.

mikroorganizmów korzeni powietrza wody substancji organicznych substancji mineralnych

Rys. 1.2. Procent objętościowy składników gleby. Zaledwie jeden procent stanowi edafon glebowy

mikro 006.jpg

Plik dostępny po zalogowaniu.

mikro 015.jpg

Plik dostępny po zalogowaniu.

MIKROBIOLOGIA laboratorium 6_Metody posiewu i hodowli (1).doc

Podgląd pliku (pełna wersja wyższej jakości po zalogowaniu):

Temat 6: Metody posiewu i hodowli drobnoustrojów (1)


Literatura:


Kocwowa E.: Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej dla wyższych szkół technicznych. PWN 1984, str. 50-58 (Pożywki mikrobiologiczne), 86-92 (Wyosabnianie czystych kultur drobnoustrojów), 101-103 (Hodowla kłuta, stosunek do tlenu), 135-141 (Metody hodowli drobnoustrojów).


Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien:

znać podstawowe wymagania pokarmowe mikroorganizmów auto- i heterotroficznych; wiedzieć, w jakim celu wykonuje się poszczególne typy posiewu; znać kryteria podziału pożywek z podaniem przykładów i krótką charakterystyką; wiedzieć, czym jest agar, agar odżywczy, bulion i żelatyna; umieć scharakteryzować mikroorganizmy pod względem ich wymagań wobec temperatury, odczynu, natlenienia i ciśnienia osmotycznego; znać metody hodowli w warunkach beztlenowych; umieć scharakteryzować podstawowe typy hodowli, w tym fazy hodowli statycznej; rozumieć różnicę między hodowlą statyczną a ciągłą;

rozumieć pojęcia: posiew, inokulum, szczep, izolacja szczepu, czystość w sensie mikrobiologicznym, kolonia, inkubacja, autotrofy, heterotrofy, prototrofy, auksotrofy, mikroorganizmy psychrofilne, mezofile, termofilne, tlenowce, beztlenowce, względne beztlenowce, mikroaerofile, czas generacji, wzrost logarytmiczny, chemostat, jednostka tworząca kolonię (jtk, cfu);

umieć wykonać podstawowe typy posiewu, w tym wyizolować czysty szczep; umieć wykonać ciąg rozcieńczeń.


Dzięki hodowli można w warunkach laboratoryjnych (in vitro) namnażać drobnoustroje żyjące w środowisku naturalnym. Aby założyć hodowlę drobnoustrojów należy wprowadzić je do sterylnej pożywki, czyli posiać. Posiewane mikroorganizmy określa się mianem inokulum lub zaszczepu. Nie zawsze znamy skład drobnoustrojów tworzących zaszczep, np. kiedy posiewamy próbę środowiskową, w której zwykle znajduje się wiele różnorodnych bakterii i grzybów (woda, ścieki, gleba itp.). Posiane drobnoustroje inkubuje się, czyli przetrzymuje w pożywce określony czas (czas inkubacji), w określonej temperaturze (temperatura inkubacji). Podczas inkubacji posiane komórki rosną i dzielą się. Trzeba jednak wspomnieć, że są drobnoustroje, które nie rosną na żadnych pożywkach i nie można ich hodować, np. krętek blady, wywołujący kiłę lub prątek trądu.


Różne mogą być cele posiewu, a więc i założonej hodowli:

  • wyizolowanie określonych drobnoustrojów z prób środowiskowych (wody, gleby), w tym uzyskanie czystych szczepów, czyli zbiorów komórek pochodzących z jednej komórki macierzystej, z zamiarem ich dalszych badań (m.in. identyfikacji),

  • namnożenie komórek już wyizolowanego i zidentyfikowanego szczepu, np. w celu pozyskania pewnych produktów jego metabolizmu, lub zbadania jego zdolności do rozkładu określonych zanieczyszczeń,

  • policzenie komórek wchodzących w skład posiewanej próby.


Pożywka, w której prowadzi się hodowlę określonych drobnoustrojów musi zaspokajać ich wymagania odżywcze. Poza tym hodowla powinna być prowadzona w optymalnych dla wzrostu warunkach środowiskowych, takich jak temperatura, odczyn, natlenienie, ciśnienie osmotyczne.


Wymagania pokarmowe.


Wszystkie bakterie i grzyby potrzebują do wzrostu i rozmnażania się źródła energii, węgla, azotu i wielu innych składników pokarmowych. Określa to łatwy do zapamiętania skrót CHOPKNS, będący szeregiem symboli chemicznych najważniejszych pierwiastków. Oprócz wymienionych składników, w każdej pożywce niezbędna jest również obecność żelaza, magnezu oraz tzw. pierwiastków śladowych, koniecznych w bardzo małych stężeniach (np. Co, Mn, Zn, Cu, Mo, Ca).

Na szczególną uwagę zasługuje zapotrzebowanie na źródło energii i węgla. W przypadku mikroorganizmów autotroficznych źródłem energii jest promieniowanie słoneczne (fotoautotrofy) lub energia utleniania zredukowanych związków nieorganicznych (chemoautotrofy), źródłem węgla natomiast obecny w atmosferze CO2. Dlatego pożywki do hodowli autotrofów nie muszą zawierać związków węgla.

Dla heterotrofów natomiast źródłem energii i węgla są związki organiczne. Pod względem zapotrzebowania na związki organiczne mikroorganizmy dzieli się na dwie grupy:

  • prototrofy, wymagające do wzrostu tylko jednego rodzaju związku węgla,

  • auksotrofy, wymagające przynajmniej dwóch rodzajów związków węgla.

Prototrofy są wyjątkowo uzdolnione metabolicznie, gdyż potrafią wszystkie potrzebne składniki komórkowe zsyntetyzować z często bardzo prostych, nawet jednowęglowych związków wyjściowych, np. metanu czy mrówczanu. Są to przede wszystkim drobnoustroje żyjące w środowisku ubogim w składniki pokarmowe (woda, gleba), ale są wśród nich również mieszkańcy środowisk bogatych w pokarm, np. występująca powszechnie w jelicie człowieka pałeczka okrężnicy (Escherichia coli).

Auksotrofami są często drobnoustroje żyjące w innych organizmach, np. liczne bakterie i grzyby chorobotwórcze. Występuje wśród nich duża rozpiętość wymagań pokarmowych, od jednego dodatkowego związku (np. pałeczka duru brzusznego Salmonella typhi wymaga aminokwasu tryptofanu) po liczne aminokwasy, zasady purynowe, pirymidynowe i witaminy potrzebne bakteriom fermentacji mlekowej.

W mikrobiologii stosuje się różne rodzaje pożywek, w zależności od celu badań. Ze względu na konsystencję można je podzielić na:

  • płynne,

  • stałe,

  • półpłynne.


Pożywki płynne stosowane są zwykle do namnażania w celu otrzymania dużej biomasy komórek i pozyskiwania produktów ich metabolizmu. Przykładem może być bulion odżywczy, jedna z najczęściej używanych pożywek. Bulion jest mieszaniną peptonu (produktu enzymatycznej hydrolizy białek), wyciągu mięsnego (ekstraktu zawierającego m.in. zasady organiczne i witaminy) i NaCl, dodawanego dla zapewnienia odpowiedniego ciśnienia osmotycznego. Na bulionie dobrze rosną mikroorganizmy o średnich wymaganiach pokarmowych, jednak dla wielu drobnoustrojów żyjących w środowiskach ubogich w pokarm (glebowych i wodnych), jest on zbyt bogatą pożywką, hamującą ich rozwój. Z kolei dla bardzo wymagających bakterii chorobotwórczych bulion jest zbyt ubogi i musi być wzbogacony, np. o krew lub wyciąg drożdżowy. Tego typu pożywki określa się mianem wzbogaconych (patrz niżej).

Pożywki stałe stosuje się głównie do izolacji czystych szczepów, przechowywania ich, do badań morfologii kolonii, oraz w badaniach ilościowych (określaniu liczby komórek w próbie). Do zestalania pożywek płynnych używa się głównie agar, a także żelatynę. W przypadku hodowli niektórych bakterii autotroficznych, wrażliwych na większe stężenia związków organicznych, stosuje się żel krzemionkowy, którym zestala się pożywkę mineralną.

Agar jest mieszaniną dwóch polisacharydów: agarozy i agaropektyny, które są polimerami galaktozy. Jest on wytwarzany przez pewne glony morskie z grupy krasnorostów, jako składnik ich ścian komórkowych. Produkuje się go w postaci proszku lub granulek. Po wymieszaniu z wodą i podgrzaniu do temp. 95-980C agar rozpuszcza się, a w trakcie schładzania zachowuje swoją płynną konsystencję do temperatury ok. 45-480C, kiedy krzepnie przechodząc w galaretowaty żel. Sam agar (tzw. agar-agar) nie jest pożywką dla większości bakterii, gdyż nie potrafią go rozkładać. Jest on używany wyłącznie do zestalania pożywek płynnych (w ilości 1,5-2 %). Dodany do bulionu odżywczego tworzy tzw. agar odżywczy, w skrócie MPA.

Żelatyna, czyli tzw. klej kostny, jest białkiem otrzymywanym w wyniku dłuższego gotowania odpadków zawierających kolagen (skóra, kości). Wadą żelatyny jako podłoża mikrobiologicznego jest to, że rozpuszcza się ona już w temp. ok. 30-350C, a więc poniżej temperatury inkubacji wielu drobnoustrojów. Niektóre bakterie i grzyby potrafią rozkładać żelatynę upłynniając ją, co jest wykorzystywane w badaniach diagnostycznych (identyfikacyjnych).

Pożywki półpłynne mają konsystencję pośrednią między pożywkami płynnymi a stałymi, i zawierają 0,15-0,2 % agaru. Służą one do badania zdolności ruchu u bakterii. Po zaszczepieniu słupka z agarem półpłynnym, bakterie zdolne do ruchu będą się przemieszczać i, dzięki małej gęstości agaru, zasiedlą całą objętość pożywki. W efekcie licznych podziałów, po okresie inkubacji powstanie zmętnienie w całej objętości słupka agarowego. W przypadku bakterii nie zdolnych do ruchu, ich podziały komórkowe spowodują jedynie wzrost wzdłuż linii wkłucia.

Inny podział pożywek uwzględnia wymagania odżywcze drobnoustrojów:

  • pożywki proste,

  • pożywki wzbogacone,

  • pożywki specjalne,

  • pożywki wybiórcze (selektywne),

  • pożywki wybiórczo-namnażające,

  • pożywki wybiórczo-różnicujące.


Pożywki proste zaspokajają niskie i średnie wymagania pokarmowe mikroorganizmów. Należą tu m.in. omówione wyżej bulion i agar odżywczy. Stanowią one podstawę dla innych, bardziej złożonych pożywek.

Pożywki wzbogacone stosuje się do hodowli bardziej wymagających drobnoustrojów chorobotwórczych (np. paciorkowców i gronkowców), przystosowanych do życia w bogatym w substancje odżywcze środowisku wnętrza organizmu żywiciela. Czynnikiem wzbogacającym może być odwłókniona krew (często barania), wyciągi z narządów zwierzęcych, np. wątroby, wyciąg z drożdży, hydrolizat kazeiny – głównego białka mleka i inne.

Pożywki specjalne służą do hodowli drobnoustrojów o szczególnych wymaganiach odżywczych, takich jak prątki gruźlicy, dwoinki rzeżączki czy maczugowce błonicy. Używa się w nich wysokowartościowych składników odżywczych (żółtka jaj kurzych, surowice, witaminy).

Pożywki wybiórcze umożliwiają wzrost określonym drobnoustrojom (które chcemy wyizolować z próby) dzięki stworzeniu im sprzyjających warunków wzrostu lub dodanie składnika hamującego wzrost niepożądanych mikroorganizmów. Przykładem może być pożywka umożliwiająca wyosobnienie z gleby bakterii Azotobacter, wiążącej azot atmosferyczny. W pożywce tej nie ma związku zawierającego azot, pierwiastek niezbędny do wzrostu wszystkim komórkom. Tylko drobnoustroje zdolne do asymilacji (przyswojenia) azotu cząsteczkowego (N2) z powietrza mogą na takiej pożywce rosnąć. Poza tym, zawiera ona mannitol, ulubione źródło węgla bakterii Azotobacter. Innym przykładem mogą być pożywki zakwaszone, które są wybiorcze dla grzybów. Obniżony odczyn hamuje wzrost większości bakterii, które zwykle preferują odczyn obojętny lub lekko zasadowy, natomiast grzyby jako mikroorganizmy kwasolubne dobrze rosną i dzielą się na takich podłożach.

Pożywki wybiórczo-namnażające są często pożywkami płynnymi i umożliwiają nie tylko wyosobnienie określonego drobnoustroju (który zwykle występuje w znikomej ilości), ale też namnożenie go do dużej biomasy umożliwiającej dalsze badania (np. identyfikacyjne). Przykładem może być podłoże z kwaśnym selenianem sodowym, stosowane do izolacji pałeczek Salmonella np. z produktów żywnościowych lub gleby (selenian jest tu czynnikiem hamującym wzrost drobnoustrojów gramdodatnich, a zwłaszcza ziarniaków).

Pożywki wybiórczo-różnicujące umożliwiają nie tylko wzrost wybranym drobnoustrojom, ale też pozwalają je zróżnicować. Przykładem może być pożywka Endo, często stosowana w sanitarnych badaniach środowiska. Pozwala ona rosnąć jedynie bakteriom gramujemnym, czyli jest dla nich wybiórcza (obecność w podłożu fuksyny hamuje rozwój bakterii gramdodatnich), ale też umożliwia zróżnicowanie wyrosłych bakterii na zdolne, i nie zdolne do fermentacji laktozy. Podczas fermentacji tego cukru powstaje bowiem aldehyd octowy, który daje czerwone zabarwienie po połączeniu się z fuksyną (dotąd bezbarwną, bo zredukowaną przez siarczyn sodu, również dodawany do pożywki). Dlatego bakterie fermentujące laktozę (jak pałeczka okrężnicy) tworzą kolonie koloru czerwonego z metalicznym (tzw. fuksynowym) połyskiem, a nie zdolne do fermentacji – koloru różowego lub bezbarwne.

Pożywki dzieli się też na:

  • syntetyczne (o ściśle zdefiniowanym składzie ilościowym i jakościowym),

  • naturalne (o nie znanym dokładnie składzie, na bazie składników pochodzenia naturalnego, np. wyciąg z tkanek roślinnych lub zwierzęcych, krew, mleko itp.),

  • półsyntetyczne (pożywka mineralna o znanym składzie, plus składniki pochodzenia naturalnego, o nie sprecyzowanym dokładnie składzie).


Temperatura

Drobnoustroje wykazują duże zróżnicowanie wymagań termicznych, które muszą być uwzględnione podczas hodowli. Dla każdego mikroorganizmu można określić trzy tzw. temperatury kardynalne:

  • minimalną, poniżej której wzrost komórek i podziały nie występują,

  • optymalną, w której komórki rosną i dzielą się najszybciej,

  • maksymalną, powyżej której wzrost i podziały nie zachodzą.

Temperatury niższe od minimalnych i wyższe od maksymalnych nie muszą być dla drobnoustrojów zabójcze, zawsze jednak hamują ich rozwój. Punkty kardynalne nie zawsze oznaczają ściśle określonej temperatury. Może to być pewien (zwykle wąski) zakres temperatur, zależny od innych czynników, np. od odczynu podłoża. Temperatura inkubacji hodowli zwykle pokrywa się z temperaturą optymalną dla danego drobnoustroju. Aby zachować właściwą temperaturę podczas rozwoju hodowli, prowadzi się ją w tzw. cieplarkach, czyli szafkach zaopatrzonych w urządzenie termostatowe umożliwiające nastawienie odpowiedniej temperatury i utrzymanie jej.

Punkty kardynalne są podstawą do podziału mikroorganizmów na trzy podstawowe grupy:

  • psychrofilne (zimnolubne), o temperaturze optymalnej ok. 200C (minimum ok. -100C, maksimum ok. 300C),

  • mezofilne (średniotemperaturowe), o optimum w 370C (minimum 150C, maksimum 450C),

  • termofilne (ciepłolubne), o optimum w 550C (minimum 300C, maksimum 750C).

Psychrofilami jest większość drobnoustrojów żyjących w środowisku wodnym i glebowym.

Mezofilami są głównie drobnoustroje żyjące w ciele (i na ciele) zwierząt stałocieplnych (ptaki i ssaki). Są wśród nich zarówno gatunki chorobotwórcze, jak i niechorobotwórcze (saprofityczne) tworzące tzw. mikroflorę organizmu.

Do mikroorganizmów termofilnych należą głównie gramdodatnie laseczki i ziarenkowce. Występują one np. w fermentujących resztkach roślinnych, np. w oborniku, kompoście, stogach siana, w nawozie, gorących źródłach itp. Istnieje też grupa mikroorganizmów prokariotycznych zwana archeonami (do niedawna zaliczana do bakterii), która żyje w warunkach ekstremalnych, gdzie temperatura przekracza 1000C. Chodzi o tzw. kominy termalne na dnie oceanów. Drobnoustroje żyjące w tak wysokich temperaturach określa się mianem ekstremalnych termofili.

Odczyn

Podobnie jak w przypadku temperatury (i innych czynników środowiska), tu również wyróżnia się dla każdego drobnoustroju wartość optymalną odczynu, jego minimum i maksimum. Odpowiednie stężenie jonów wodorowych (którego ujemny logarytm oznacza się jako pH) ma poważny wpływ na rozwój komórek. Większość bakterii preferuje odczyn obojętny lub lekko zasadowy (pH ok. 7 – 7,5), grzyby natomiast lepiej rosną w środowisku kwaśnym (pH ok. 5,2 – 5,6). W trakcie hodowli, jej odczyn dość szybko się zmienia, z powodu powstawania produktów przemiany materii. Aby utrzymać optymalny odczyn, pożywki przygotowuje się na bazie odpowiednich buforów


Natlenienie

Pod względem stosunku do tlenu mikroorganizmy dzieli się na:

  • Bezwzględne tlenowce (bezwzględne aeroby),

  • Bezwzględne beztlenowce (bezwzględne anaeroby),

  • Względne beztlenowce (względne anaeroby),

  • Mikroaerofile.

Bezwzględne tlenowce, jak sugeruje ich nazwa, wymagają warunków tlenowych w stężeniu atmosferycznym (20%). W hodowli nie napowietrzanej na pożywce płynnej (np. bulionie), rosną tylko na powierzchni, w postaci kożuszka, pozostawiając pożywkę przezroczystą (np. laseczki z rodzaju Bacillus i wiele grzybów). W głębi pożywki mogą one rosnąć jedynie w warunkach napowietrzania.

Bezwzględne beztlenowce nie tolerują tlenu, ponieważ w jego obecności powstaje w procesach metabolizmu nadtlenek wodoru (H2O2), związek silnie utleniający, a drobnoustroje te nie wykazują aktywności katalazowej (katalaza jest enzymem rozkładającym H2O2). Przykładem bezwzględnych beztlenowców są niektóre laseczki z rodzaju Clostridium, np. laseczka tężca (C. tetani). Hodowla takich bakterii wymaga usunięcia tlenu z pożywki, co można osiągnąć różnymi metodami (patrz niżej).

Względne beztlenowce mogą rozwijać się zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych. Przykładem może być pałeczka okrężnicy (Escherichia coli), pospolity mieszkaniec jelita grubego człowieka. W nie napowietrzanej hodowli bulionowej rośnie ona w całej objętości pożywki (a więc w miejscach o różnym stopniu natlenienia) tworząc jednolite zmętnienie. Ten typ wzrostu określa się jako dyfuzyjny.

Mikroaerofile to drobnoustroje wymagające do wzrostu tlenu, ale w niewielkim stężeniu, dlatego w nie napowietrzanej hodowli na pożywce płynnej tworzą zmętnienie tylko na pewnej głębokości pożywki, gdzie stężenie tlenu jest odpowiednio niskie. Przykładem mogą być bakterie fermentacji mlekowej z rodzaju Lactobacillus.

Aby zapewnić dobre natlenienie hodowli, stosuje się wytrząsanie (w hodowlach płynnych), doprowadzanie powietrza za pomocą pompki membranowej (w każdym typie hodowli) oraz zapewnienie możliwie dużych powierzchni wymiany gazów (szczególnie w przypadku hodowli na podłożach stałych).

Warunki beztlenowe w hodowli można osiągnąć różnymi metodami, m.in. przez:

  • zagotowanie pożywki bezpośrednio przed posiewem,

  • wprowadzenie na powierzchnię pożywki płynnej warstwy sterylnej parafiny,

  • posiew wgłębny w podłożu zestalonym,

  • dodanie do pożywki związków redukujących, które obniżają potencjał oksydacyjno-redukcyjny (kwas askorbinowy, tioglikolan sodu),

  • hodowlę w jednym naczyniu hodowlanym (szczelnie zamkniętym) tlenowców i beztlenowców (tlenowce zużywają tlen i stwarzają warunki beztlenowe),

  • hodowlę w tzw. anerostatach, w których powietrze jest usuwane np. pompką wodną, a w jego miejsce wprowadzany gaz obojętny, np. azot,


Ciśnienie osmotyczne

Większość drobnoustrojów może rosnąć tylko przy określonym stężeniu soli, w roztworze izotonicznym (stężenie soli na zewnątrz i wewnątrz komórki są sobie równe). Komórki w roztworze hipotonicznym, gdy stężenie soli na zewnątrz komórki jest mniejsze i woda ma tendencje do wnikania do wnętrza, mogą ulec pęknięciu (dzięki ścianie komórkowej udaje im się jednak wytrzymać określony napór wody). Z tego powodu do rozcieńczania prób w mikrobiologii nie stosuje się wody destylowanej, lecz roztwór fizjologiczny będący 0,85% roztworem NaCl. W roztworach hipertonicznych (stężenie na zewnątrz jest większe) przeżywalność komórek zależy od zdolności do przeciwstawiania się wypływowi wody i wysuszeniu. Drobnoustroje zdolne do wytrzymywania większych stężeń soli (do ok. 15%) określane są mianem osmotolerancyjnych (np. gronkowce), natomiast te, które wytrzymują jeszcze wyższe stężenia to tzw. osmofile lub halofile (niektóre archeony).


Rodzaje hodowli.


Hodowle dzieli się zwykle na:

  • statyczne (okresowe),

  • ciągłe,

  • zsynchronizowane.

W hodowli statycznej mikroorganizmy posiane do pożywki rosną i rozmnażają się do czasu wyczerpania się składników pokarmowych lub (i) nagromadzenia się toksycznych produktów przemiany materii. W tego typu hodowli rozwój populacji bakterii przebiega w kilku charakterystycznych fazach, które można zobrazować na wykresie w postaci tzw. krzywej wzrostu:

  • faza zastoju,

  • faza wzrostu logarytmicznego (wykładniczego),

  • faza stacjonarna,

  • faza zamierania.

W fazie zastoju w zaszczepionych komórkach (inokulum) zachodzą procesy adaptacji polegające na syntezie potrzebnych enzymów, replikacji DNA, syntezie białek i w efekcie komórki zwiększają swoje rozmiary. Długość tej fazy zależy od podobieństwa warunków hodowli poprzedniej (z której pochodzi inokulum) do warunków panujących w nowej hodowli. Im jest ono większe, tym faza jest krótsza.

W fazie wzrostu logarytmicznego komórki zaczynają się dzielić. Sygnałem do podziałów jest osiągnięcie przez komórki odpowiedniej długości. Każda komórka dzieli się na dwie. Po określonym czasie wzrostu powstałe komórki znowu dzielą się na dwie, stąd liczbę powstałych komórek (czyli wzrost populacji) określa wzór 2n, gdzie n – to liczba podziałów, która jest równoznaczna z liczbą pokoleń. Czas między dwoma kolejnymi podziałami, to tzw. czas generacji lub wiek osobniczy. Zależy on od warunków hodowli i od cech gatunkowych drobnoustroju. W konkretnej hodowli jest on więc stały. Jeśli liczba komórek w inokulum wynosi N0, to powstała liczba komórek N po n pokoleniach wyniesie N = N0 x 2n. Liczba bakterii podwaja się co każdy okres generacji, rośnie więc wykładniczo z upływem czasu. Do czasu hodowli proporcjonalny jest więc logarytm liczby bakterii, a nie sama ich liczba. Stąd nazwa – faza logarytmiczna.

W fazie stacjonarnej obserwuje się spadek przyrostu liczby bakterii, w wyniku zamierania części komórek z powodu wyczerpywania się składników pokarmowych, tlenu i wytwarzania produktów przemiany materii. Zamieranie to jest w pewnej równowadze z dzieleniem się innych komórek

Z czasem komórek zamierających jest więcej i dochodzi do spadku ogólnej liczby komórek – hodowla się przerzedza i z czasem zamiera.

Jednak opisana sekwencja zdarzeń w hodowli może być inna. Jeśli tylko zapewni się usuwanie zużytego podłoża i zastępowanie go świeżym, to możliwe jest utrzymywanie fazy wzrostu logarytmicznego praktycznie w nieskończoność. Na tym właśnie polega hodowla ciągła. Jest więc ona, w przeciwieństwie do hodowli statycznej, układem otwartym, z ciągłym przepływem pożywki (zużytej i świeżej). Prowadzi się ją w tzw. chemostatach, umożliwiających kontrolowanie wzrostu komórek za pomocą dozowania odpowiednich ilości pożywki i regulowania szybkości przepływu. Dzięki temu możliwe jest uzyskanie stanu równowagi, w którym zagęszczenie komórek jest stałe. Ma to duże znaczenie w badaniach procesów fizjologicznych drobnoustrojów, kiedy niezbędne są warunki stabilne. Hodowle ciągłe są wykorzystywane m.in. w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym, do produkcji określonych substancji (np. kwasu octowego, antybiotyków) i biomasy (np. drożdży). Hodowle w procesach produkcyjnych prowadzi się w bioreaktorach (fermentorach). Rodzajem hodowli ciągłej jest również biologiczna oczyszczalnia ścieków, w której hoduje się bakterie (jako tzw. osad czynny) na bazie pożywki, jaką stanowią ciągle dopływające ścieki.

Hodowla zsynchronizowana to hodowla, w której komórki dzielą się równocześnie (czyli synchronicznie), w przeciwieństwie do innych hodowli, gdzie podziały komórek są nieskoordynowane. Dzięki jednoczesności podziałów, zmiany w hodowli synchronicznej są odzwierciedleniem (zwielokrotnieniem) zmian w pojedynczej komórce. Umożliwia to badanie przemian zachodzących w cyklu życiowym komórki, zwykle nieuchwytnych ze względu na zbyt małą czułość metod badawczych. Zsynchronizowanie podziałów można osiągnąć wieloma metodami, m.in. przez szok wywołany niską temperaturą. Bakterie przenosi się na ok. 15 – 60 min. do temperatury dużo niższej od optymalnej. W tych warunkach dochodzi do zrównania stanu fizjologicznego komórek, które przeniesione do temperatury optymalnej, równocześnie zaczynają podziały komórkowe. Osiągnięta synchronizacja nie jest trwała i, jeśli nie jest utrzymywana, szybko spontanicznie zanika.





CZĘŚĆ PRAKTYCZNA:

Zadanie 1. Posiew izolacyjny na podłoże stałe (agar odżywczy)

Celem tego posiewu jest wyizolowanie czystych szczepów drobnoustrojów w postaci kolonii. Czysty szczep to zbiór komórek pochodzących od jednej komórki macierzystej. Posiew izolacyjny, zwany też redukcyjnym, polega na rozprowadzaniu zawiesiny komórek za pomocą ezy, po powierzchni pożywki agarowej. W miarę przeciągania ezy po pożywce, liczba drobnoustrojów przenoszonych na powierzchnię podłoża będzie coraz mniejsza, aż w końcu na oczku ezy pozostaną nieliczne komórki, które będą się pojedynczo przyklejać do pożywki. Każda z tych oddzielonych od siebie komórek zacznie się dzielić i utworzy odrębną kolonię – wyizolowany czysty szczep.


W celu wykonania posiewu, należy:

  1. Wyżarzyć i schłodzić ezę

  2. Pobrać ezą zawiesinę bakterii i delikatnie rozprowadzić ją po powierzchni agaru stosując jedną z wybranych technik

  3. Po posiewie ponownie wyżarzyć ezę

  4. Posiane hodowle inkubować w temperaturze pokojowej przez kilka dni

  5. Po inkubacji ocenić, czy udało się wyizolować czyste szczepy i ile różnych szczepów znajdowało się w posiewanej zawiesinie.


Zadanie 2. Posiew ezą na skos agarowy

Hodowle na skosie agarowym stosuje się głównie do przechowywania szczepów.

W celu wykonania posiewu, należy:

1. Wyżarzyć i schłodzić ezę

2. Pobrać ezą zawiesinę określonego szczepu bakterii i delikatnie rozprowadzić ją po

powierzchni skosu agarowego zaczynając od dołu i prowadząc ezę zygzakiem ku górze

skosu

  1. Po posiewie ponownie wyżarzyć ezę

  2. Posianą hodowlę inkubować w temperaturze pokojowej przez kilka dni


Po inkubacji opisać efekty posiewu (intensywność wzrostu, kolor, połyskliwość itp.)



Zadanie 3. Posiew na podłoże płynne (bulion odżywczy).

Posiew stosuje się w celu określenia stosunku do tlenu danej bakterii (czy jest ona tlenowcem czy względnym beztlenowcem).

1. Pobrać ezą zawiesinę określonego szczepu bakterii i przenieść do probówki z bulionem

odżywczym lekko wstrząsając ezą po włożeniu do bulionu

  1. Posianą hodowlę inkubować w temperaturze pokojowej przez kilka dni.


Po inkubacji, na podstawie obserwowanego typu wzrostu hodowli określić, czy posiany szczep jest tlenowcem czy względnym beztlenowcem.


Zadanie 4. Posiew na podłoże płynne fermentacyjne

Posiew ten służy do badania zdolności danego szczepu do fermentacji określonego cukru, co przejawia się zmianą zabarwienia pożywki i wytworzeniem gazu zbieranego w rurce Durhama.

1. Pobrać ezą zawiesinę określonego szczepu bakterii i przenieść do probówki z pożywką

2. Posianą hodowlę inkubować w odpowiedniej temperaturze.

Po inkubacji określić zdolność posianego szczepu do fermentacji cukru zawartego w pożywce.


Zadanie 5. Posiew metodą kłutą na słupek agarowy z TTC

Posiew ten stosuje się do zbadania zdolności bakterii do ruchu (nie wszystkie bakterie

potrafią się czynnie przemieszczać). Jeśli badany szczep wykazuje zdolność poruszania się, to zostawia po sobie ślad koloru czerwonego, jako efekt enzymatycznego przekształcenia obecnego w pożywce bezbarwnego związku TTC w czerwony TF. Reakcję tę katalizuje enzym dehydrogenaza, aktywny w procesach energetycznych.

1. Pobrać igłą mikrobiologiczną (eza bez oczka) zawiesinę określonego szczepu

bakterii poprzez zwykłe zanurzenie jej w zawiesinie.

2. Zaszczepić słupek agarowy przez wkłucie igły aż do dna słupka (można to wykonać

trzymając probówkę ze słupkiem dnem do góry i wkłuwając się od dołu)

Po tygodniowej inkubacji ocenić zdolność posianego szczepu do aktywnego ruchu na

podstawie stwierdzenia zaczerwienienia pożywki poza miejscem wkłucia.


Zadanie 6. Posiew metodą kłutą na słupek żelatynowy

Posiew stosuje się do badania zdolności danego szczepu do hydrolizy białka, czyli proteolizy (żelatyna to białko kostne) co przejawia się upłynnieniem żelatyny.

Wykonać posiew jak w zadaniu 5.

Po tygodniowej inkubacji w temperaturze pokojowej ocenić zdolność szczepu do upłynniania żelatyny.


Zadanie 7. Posiew metodą wgłębną na płytki Petriego

Ten typ posiewu jest często stosowany w badaniach ilościowych (do określenia liczby komórek w badanym materiale). Przed posiewem należy próbę rozcieńczyć.

Wykonanie rozcieńczenia (schemat):

  1. Ustawić w statywie szeregowo 6 probówek zawierających każda po 9 cm3 roztworu fizjologicznego (liczba probówek jest proporcjonalna do spodziewanego zagęszczenia drobnoustrojów w próbie wyjściowej)

  2. Do pierwszej probówki wprowadzić pipetą 1cm3 wyjściowej zawiesiny drobnoustrojów i wymieszać na mikrowytrząsarce. Uzyska się w ten sposób 10-krotne rozcieńczenie próby

  3. Zmienić końcówkę pipety, pobrać 1cm3 10-krotnego rozcieńczenia i przenieść do następnej probówki z roztworem fizjologicznym, a następnie wymieszać w celu otrzymania rozcieńczenia 100x

  4. Postępując podobnie, wykonać kolejne rozcieńczenia: 103x, 104x , 105x i 106x.


Wykonanie posiewu:

  1. Przygotować 6 sterylnych szalek Petriego, przeznaczając każdą na inne rozcieńczenie, i odpowiednio opisać

  2. Zaczynając od największego rozcieńczenia (106x), pobrać pipetą (używając jednej końcówki) po 1cm3 z każdego rozcieńczenia i wlać do odpowiednich szalek Petriego

  3. Do wszystkich szalek wlać płynny agar (schłodzony do temp. ok. 450C) i wymieszać z wprowadzonymi uprzednio rozcieńczeniami. Pozostawić do zastygnięcia

  4. Inkubować przez kilka dni w temp. pokojowej

Po inkubacji określić liczbę komórek drobnoustrojów w 1cm3 próby wyjściowej. W tym celu policzyć wszystkie wyrosłe kolonie z płytek, na których jest ich od 30 do 300 (zwrócić uwagę na dwa typy kolonii: wgłębne i powierzchniowe) Uwzględnić rozcieńczenie posianej próby oraz jej objętość, i ostatecznie wyrazić liczebność w jednostkach tworzących kolonię na cm3 badanej zawiesiny (jtk/cm3 lub cfu/cm3; skrót cfu oznacza właśnie „jednostkę tworzącą kolonię”, z ang. „colony forming unit”). Porównać z wynikami uzyskanymi metodą posiewu powierzchniowego (Zad.8).

.

Zadanie 8. Posiew metodą powierzchniową głaszczką na podłoże stałe.

Ten typ posiewu, podobnie jak poprzedni, jest często stosowany w badaniach ilościowych. Ma on jednak tę przewagę nad posiewem wgłębnym, że nie dochodzi tu do szoku temperaturowego powodowanego wylewaniem gorącego agaru. Poza tym, metoda ta lepiej nadaje się do hodowli mikroorganizmów tlenowych, np. grzybów.

Przed posiewem wykonać rozcieńczenie próby, podobnie jak w Zad.7.

Posiew wykonać na płytki Petriego z już wylanym, zastygłym agarem odżywczym.


Wykonanie posiewu:

  1. Przygotować 6 płytek Petriego z agarem odżywczym, przeznaczając każdą na inne rozcieńczenie, i odpowiednio opisać.

  2. Jedną pipetą pobrać po 0,1 cm3 z każdego rozcieńczenia, zaczynając od największego, i wylać na powierzchnię agaru odpowiedniej płytki.

  3. Wysterylizować głaszczkę w płomieniu palnika i odczekać aż ostygnie.

  4. Wylaną zawiesinę rozprowadzić równomiernie sterylną głaszczką po całej powierzchni agaru. Odłożyć głaszczkę do zlewki z alkoholem.

  5. Posiane płytki inkubować przez tydzień w temp. pokojowej.

Po inkubacji określić liczbę komórek drobnoustrojów w 1cm3 próby wyjściowej. W tym celu policzyć wyrosłe kolonie z płytek, na których jest ich od 30 do 300. Uwzględnić rozcieńczenie posianej próby oraz jej objętość, i wyrazić liczebność w jtk/cm3 (lub cfu/cm3). Porównać z wynikami uzyskanymi metodą posiewu wgłębnego (Zad.7).


PROCESY MEMBRANOWE W PRZEMYŚLE SPOŻYWCZYM.pdf

Podgląd pliku (pełna wersja wyższej jakości po zalogowaniu):


PROCESY MEMBRANOWE W PRZEMYŚLE SPOśYWCZYM

OPRACOWANIE: P. KRÓLICZAK, T. JANKOWSKI



Współczesna technologia zna wiele metod oczyszczania produktów, jak np. chromatografię wielko- składnikową, wytrącanie, krystalizację, wirowanie, destylację, sedymentację i inne. Membranowe techniki rozdzielania mieszanin przez długi okres czasu traktowane były jako pomocnicze metody separacyjne w skali laboratoryjnej. Ostatnie lata sprawiły, Ŝe moŜliwym stało się stosowanie technik membranowych na duŜą skalę. Związane to jest z rozwojem chemii tworzyw sztucznych, szczególnie polimerów syntetycznych, z których zbudowana jest większość wysoce przepuszczalnych i selektywnych membran.

W technologii Ŝywności stosuje się z powodzeniem takie odmiany technik membranowych, jak: mikrofiltracja, ultrafiltracja, odwrócona osmoza, elektrodializa, nanofiltracja. Korzyści wynikające ze stosowania wyŜej wymienionych metod to przede wszystkim:

- moŜliwość jednoczesnego zagęszczania, frakcjonowania i oczyszczania roztworów - redukcja do minimum termicznej degradacji składników Ŝywności i mikroorganizmów - niskie zuŜycie energii - eliminacja przemian fazowych rozdzielanych składników (jak np. przy destylacji) - prosta, modułowa budowa urządzeń.

PODSTAWOWE POJĘCIA I PARAMETRY OPISUJĄCE TECHNIKI MEMBRANOWE

Permeat – filtrat; roztwór przenikający przez membranę filtracyjną, zawierający rozpuszczalnik wraz z cząstkami, które nie zostały zatrzymane na filtrze.

Retentat – roztwór zawierający zatrzymane na filtrze cząstki.

Polaryzacja stęŜeniowa membrany – zjawisko adsorpcji drobin na powierzchni membrany, powodujące zalepianie się por. pod wpływem adsorpcji na powierzchni membrany, powodujące zlepianie się por. pod wpływem działającego na membranę ciśnienia, zatrzymane na niej cząstki akumulują się tworząc warstwę Ŝelową lub tzw. Wtórną membranę. Powoduje to spadek szybkości filtrowania.

Strumień objętości (flux rate)

WyraŜa objętość otrzymanego permeatu na jednostkę powierzchni filtra. W początkowym etapie filtracji, gdy filtr nie jest jeszcze zapchany, przyjmuje wartość:

∆ ∆

gdzie: ∆P – transmembranowa róŜnica ciśnień ∆Π - róŜnica ciśnień osmotycznych filtrowanego roztworu i permeatu R

g

– opór hydraulityczny warstwy Ŝelu R

m

– opór hydraulityczny membrany.

PoniewaŜ ciśnienie osmotyczne dla makromolekuł w roztworze jest bardzo niskie i rośnie dopiero w przypadku wysokiej koncentracji warstwy Ŝelowej na membranie, to wzór ma postać:

Gdy membrana ulega polaryzacji, tworzy się na niej warstwa Ŝelu, wówczas strumień objętości wyraŜamy jako:

gdzie: K – współczynnik przenikania masy C

g

– koncentracja warstwy Ŝelu C

s

– koncentracja filtrowanego roztworu.

Współczynnik odrzucenia R – wyraŜa ilość materiału, który przechodzi przez membranę lub jest przez nią odrzucany. Gdy R ma wartość równą 1, to 100 % materiału jest odrzucane, gdy wartość ta wynosi 0, to membrana jest całkowicie przepuszczalna. WyraŜa to wzór:

2



/ /

gdzie: C

f

– końcowa koncentracja roztworu w retentacie C

0

– początkowa koncentracja roztworu V V

0

f

– początkowa objętość roztworu – końcowa objętość retentatu.

Równanie to jest prawidłowe przy załoŜeniu, Ŝe retentat jest całkowicie homogenny, co jest jednak warunkiem do osiągnięcia z powodu tworzącej się na membranie warstwy Ŝelowej. Wartość współczynnika R jest funkcją molekularnej wielkości i kształtu rozdzielonych cząstek.

Punkt odcięcia (cut-off) – masa molekularna, przy której co najmniej 90 % cząstek globularnych o tej właśnie masie jest na danym filtrze zatrzymywane. W wielu przypadkach punkt odcięcia jest właśnie tą wielkością, którą producent podaje na opakowaniu, jako róŜnicującą poszczególne filtry.

MODYFIKACJE PROCESÓW MEMBRANOWYCH

Przeciwdziałanie zjawiskom powodującym zanieczyszczenia membran spowodowało duŜy postęp w dziedzinie konfiguracji modułów membranowych, materiałów membran i optymalizacji dynamiki cieczy w sąsiedztwie membrany. Wydajność procesów membranowych znacznie się zwiększyła po opracowaniu systemu wykorzystującego przegrody (cross-flow). Zasadę filtracji stycznej opisuje rysunek:

Jednym z parametrów charakterystycznych dla filtracji stycznej jest ciśnienie transmembranowe, które przyjmuje tu wartość:

2

gdzie: P

i

– ciśnienie na wejściu P P

0

f

– ciśnienie na wyjściu – ciśnienie filtratu

Zaletą tego układu jest stosunkowo wolniejsze niŜ w typowej filtracji zapychanie się membrany, a to dzięki temu, iŜ styczny ruch cieczy nieustannie zmywa tworzącą się na powierzchni filtra warstwę zanieczyszczeń. Wydajność i efektywność procesów membranowych jest dodatkowo polepszana poprzez niewielkie wymiary przekrojów przepływu zawiesin i roztworów. Zapewnia to burzliwy ruch cieczy i duŜe siły ścinające na powierzchni membrany. Znane są teŜ rozwiązania konstrukcyjne mikrofiltrów z wirującymi

3



powierzchniami filtrującymi, a takŜe układy, w których zachodzi przepływ pulsacyjny lub teŜ kierunek przepływu zawiesiny jest co pewien czas odwracalny tak, aby zakłócić ustalony profil polaryzacji stęŜeniowej i usunąć cząstki z powierzchni membrany.

RODZAJE FILTRÓW STOSOWANYCH W PROCESACH MEMBRANOWYCH

Filtry stosowane w procesach membranowych są zwykle wykonane z materiałów ceramicznych lub syntetycznych polimerów, takich jak polisulfon, teflon czy octan celulozy. Materiały te nie są cytotoksyczne, ani teŜ w Ŝaden inny sposób nie wpływają na filtrowany roztwór.

Ściany membran filtrów charakteryzują się anizotropową strukturą, tzn. kanały por rozszerzają się od powierzchni membrany w głąb jej struktury. Dzięki temu cząsteczki, które są zatrzymywane przez daną membranę, zatrzymują się na jej powierzchni i nie zapychają światła kapilar w jej wnętrzu.

Stosowane są 3 podstawowe typy filtrów:

- płaskie - spiralne - kapilarne. - Filtry płaskie (flat disc) stosuje się często w konfiguracji z innymi rodzajami separatorów, np. wirowaniem komórek.

Filtry kapilarne zbudowane są z wiązki cienkich rurek umieszczonych w cylindrycznym pojemniku. Ciecz zawierająca oddzielane cząstki przepływa przez kapilary, gdzie ulega rozdzieleniu: cząsteczki małe przenikają przez ściany membrany na zewnątrz do przestrzeni między-kapilarnej, zaś cząsteczki duŜe opuszczają kapilary.

Filtry spiralne zbudowane są z membran nawiniętych spiralnie na cylindryczny przewód odbierający filtrat.

Wybór stosowanej membrany zaleŜy od wielu czynników, np. strumienia objętości przepływu, masy molekularnej odcinanych cząstek, lepkości roztworu, stopnia adsorpcji białek, itp.

PODZIAŁ I CHARAKTERYSTYKA PROCESÓW MEMBRANOWYCH

Podział procesów membranowych przedstawiony poniŜej opiera się na wielkości rozdzielanych w danej metodzie cząstek za pomocą tradycyjnych metod separacji moŜna rozdzielić cząstki o wielkości nie mniejszej niŜ 2 μm. Wszystkie mniejsze cząstki mogą być wydzielane z roztworów za pomocą technik membranowych. Wielkość rozdzielanych cząstek jest podstawą przedstawionego poniŜej podziału.

Mikrofiltracja (MF)

W mikrofiltracji uŜywa się membran o porach rzędu 0,1-5 μm. Za pomocą mikrofiltracji usuwa się z roztworu drobne zawiesiny, komórki bakteryjne, niektóre wirusy, drobiny surowców roślinnych, cząstki tłuszczu w emulsjach (np. mleka). Wizualnym efektem tego procesu moŜe być zmiana barwy filtratu, obniŜenie się mętności, spadek intensywności rozpraszania światła. Głównym zastosowaniem mikrofiltracji jest więc klasyfikacja roztworów, wydzielanie biomas komórkowych, a takŜe sterylizacja poŜywek (tzw. Sterylizacja „na zimno”).

Siła napędową procesu mikrofiltracji jest róŜnica ciśnień hydrostatycznych po obu stronach przegrody, rzędu 0,05-0,5 MPa. Mikrofiltrację prowadzi się często w układzie stycznym (filtracja styczna, ang. „cross- flow”, „tangential flow”, co w większej mierze zapobiega odkładaniu się osadu na powierzchni membrany.

Ultrafiltracja (UF)

Membrany stosowane w ultrafiltracji mają pory rzędu 0,005-0,1 μm (5-100 nm), a róŜnica ciśnień na membranie w tym procesie wynosi 0,2-1,0 MPa.

4



Proces UF umoŜliwia jednoczesne frakcjonowanie i zagęszczanie wybranych składników cieczy. Permeat po UF nie zawiera juŜ białek, polisacharydów, wirusów, niektórych barwników, enzymów i witamin, natomiast pozostają w nim proste cukry, kwasy organiczne, zdysocjowane jony nieorganiczne i większość produktów degradacji cieplnej. Mętność ultrafiltratu całkowicie zanika i nie obserwuje się juŜ zjawiska rozpraszania światła.

Nanofiltracja (NF)

Nanofiltracja to proces, który obejmuje zakres separacji o wymiarach w granicach 0,001-0,005 μm (1- 5 nm). Zatrzymywane są tu aminokwasy, proste cukry, enzymy i niektóre jony. Frakcja ta zawiera więc większość substancji pochłaniających promieniowanie ultrafioletowe (cukry i produkty ich rozpadu), substancje odpowiedzialne za smak i zapach, substancje zabarwiające. Permeat jest jasno zabarwiony, klarowny, zawiera tylko niektóre sole i cząstki o małej masie cząsteczkowej (np. alkohole).

Sposób separacji składników w procesie NF jest połączeniem przepływu kapilarnego, typowego dla MF i UF, z mechanizmem rozpuszczająco-dyfuzyjnym, charakterystycznym dla odwróconej osmozy (RO). Membrany nanofiltracyjne posiadają róŜne zakresy selektywności, począwszy od przegród o wysokiej nieprzepuszczalności dla NaCl, poprzez membrany wybiórczo zatrzymujące niektóre jony, do takich, które zatrzymują cząsteczki kwasów.

Odwrócona osmoza (RO)

Proces ten przebiega na membranach o średnicy por 0,0001-0,001 μm (0,1-1,0 nm). Przez taką przegródkę przenika wyłącznie rozpuszczalnik, tak więc RO moŜe być uwaŜana bardziej za proces zagęszczania niŜ separacji. Przepływ rozpuszczalnika następuje przeciwnie do ciśnienia osmotycznego, toteŜ, aby proces RO mógł zajść musi być wytworzona duŜa róŜnica ciśnień po obu stronach membrany, rzędu 1-10 MPa. Mechanizm selektywnego działania membran RO tłumaczy się modelem rozpuszczająco-dyfuzyjnym, gdzie znaczenie ma powinowactwo membrany i składników roztworu oraz szybkość ich transportu w membranie. Składniki o większym powinowactwie do materiału membrany, rozpuszczają się w niej łatwiej od innych składników, a membrana spełnia funkcję fazy ekstrakcyjnej. W dalszym etapie procesu zachodzi transport składników w membranie na zasadzie dyfuzji molekularnej, zaś róŜnice w dyfuzyjności danego składnika decydują o przepuszczalności membrany. Selektywność membran RO jest więc połączonym efektem rozpuszczalności i dyfuzyjności składników zagęszczonego roztworu.

Membrany stosowane w RO mają strukturę niesymetryczną, z warstewką selektywną o submikronowej grubości, wykonaną najczęściej z octanu i innych estrów celulozy oraz z poliamidów, naniesioną na 2-gą, grubszą warstwę podporową o większej porowatości.

Proces RO stosuje się od wielu lat na duŜą skalę do otrzymywania wody pitnej z wód morskich i wód zasolonych oraz do uzdatniania wody w przemyśle farmaceutycznym i elektronicznym.

Perwaporacja (PV)

Perwaporacja pozwala na rozdzielenie ciekłej mieszaniny z częściowym jej odparowaniem – permeat występuje w postaci pary. Membrany stosowane w PV mają porowatość podobną jak w RO, a transport masy zachodzi na zasadzie mechanizmu sorpcyjno-dyfuzyjnego. Tak więc, po 1 stronie membrany następuje adsorpcja i rozpuszczanie się składników danego roztworu; następnie rozpuszczone cząsteczki dyfundują w membranie i z jej strony ulegają desorpcji („odparowaniu”).

Efekt rozdzielania składników roztworu wynika, podobnie jak w RO, z róŜnic sorpcji i rozpuszczalności w membranie. RóŜnice te są natomiast efektem specyficzności oddziaływań układu membrana-ciecz lub teŜ wynikiem uprzywilejowanej sorpcji cząstek o mniejszym rozmiarze.

Praktyczne zastosowanie procesu perwaporacji zmierza do zastąpienia tym procesem konwencjonalnej destylacji.

Elektrodializa (ED)

Elektrodializa to proces membranowego rozdzielania roztworów ciekłych, których składniki jonowe (sole, kwasy, zasady) przenikają przez membrany pod wpływem róŜnicy potencjałów zewnętrznego pola elektrycznego. W procesie tym membrany są jonowymienne, mają albo ładunek dodatni (przepuszczalne dla anionów – anionity), albo ładunek ujemny (przepuszczalne dla kationów - kationity). Kationity wytwarzane są poprzez fizyczne lub chemiczne unieruchomienie w cienkich foliach wykonanych z polimerów, grup sulfonowych o właściwościach silnie kwaśnych lub grup karboksylowych o właściwościach słabo kwaśnych.

5



Anionity natomiast mają unieruchomione grupy amoniowe, silnie zasadowe lub słabo zasadowe grupy aminowe czy teŜ fenolowe. W ostatnich opracowano juŜ membranę dwupolarną, umoŜliwiającą elektrodializę w pojedynczej membranie.

Proces ED ma zastosowanie do odsalania morskiej oraz uzdatniania wody technologicznej, a takŜe do innych procesów demineralizacji.

Omówione wyŜej procesy membranowe przedstawiono na schemacie, uwzględniając wymiarowe spektrum róŜnych substancji występujących w ciekłych artykułach Ŝywnościowych.

ZASTOSOWANIE PROCESÓW SEPARACJI MEMBRANOWEJ W PRZEMYŚLE SPOŻYWCZYM

Procesy membranowe są w technologii Ŝywności atrakcyjną alternatywą do tradycyjnie stosowanych metod separacyjnych, a to ze względu na niedestrukcyjne oddziaływanie na produkt i niskie zuŜycie energii.

W tabeli zestawiono przykłady zastosowania procesów membranowych w róŜnych działaniach towarzyszących produkcji Ŝywności.

Zastosowanie Produkt Proces membranowy

„Zimna” sterylizacja

Piwo, poŜywki wino, fermentacyjne

mleko, moszcze,

MF

Klarowanie Piwo, wino, soki owocowe MF, UF

Zagęszczanie

Białka, barwniki, enzymy

soki owocowe, kawa,

UF, RO

Usuwanie alkoholu Piwo, wino RO, PV

Frakcjonowanie

Białka, biotechnologii

węglowodany, produkty

UF, RO

Odzysk produktu

Kwas ocet, alkohol mlekowy, etylenowy

kwas cytrynowy,

UF, ED, PV

Poprawa jakości produktu Substancje smakowo-zapachowe RO, PV Odsalanie, demineralizacja Woda, serwatka RO, NF, ED

Przemysł mleczarski

Pierwsze zastosowania procesów ultrafiltracji w mleczarstwie dotyczyły utylizacji serwatki. Serwatkę najpierw poddawano procesowi UF, w którym oddzielano frakcję białkową, a następnie RO, otrzymując zagęszczony roztwór laktozy oraz permeat o niskim BZT. Korzyści wynikające zatem ze stosowania procesów membranowych, w tym przypadku polegają na moŜliwości otrzymywania 30-80 % koncentratów białkowych pozbawionych laktozy, zagęszczonego do ok. 25 % roztworu laktozy, a przy tym powstający ściek ma niskie BZT.

Stosując dalej odpowiednio dobrane membrany, białka moŜna jeszcze rozdzielić na α-laktoalbuminę i β- laktoglobulinę, laktoferynę, laktoperoksydazę i glikomakropeptyd.

6



Frakcjonowanie białek serwatkowych w procesie UF

W serowarstwie powszechną praktyką jest wstępne zagęszczanie mleka przy uŜyciu UF, poprzedzające koagulację. Poprzez to wartość odŜywcza sera jest wyŜsza dzięki wzbogaceniu go w białka, witaminy i niektóre substancje mineralne, tracone w serwatce w tradycyjnym procesie.

WaŜną zaletą technik membranowych jest moŜliwość „zimnej” sterylizacji. Mleko poddawane procesowi MF jest nikrobiologicznie czyste i nie jest wówczas wymagana typowa pasteryzacja. Pojawiają się jednak doniesienia mówiące o tym, Ŝe przy stosowaniu membran, które pozwalają na zachowanie przez mleko wszystkich jego białkowych składników, w permeacie zostaje część drobnoustrojów.

Przemysł owocowo-warzywny

W przemyśle tym procesy membranowe stosuje się do klarowania i zagęszczania soków, moszczów oraz wina, do wydzielania substancji aromatycznych z ekstraktów owocowych, do zagęszczania barwników roślinnych oraz do usuwania alkoholu z wina.

Dzięki technologiom membranowym moŜna wyeliminować tak uciąŜliwe procesy jak filtracja przy uŜyciu ziemi okrzemkowej, bentonitu, zolu krzemionkowego i Ŝelatyny. Jednocześnie, stosując instalacje membranowe, mniejsza jest powierzchnia produkcyjna, mniejsze jest zuŜycie energii czy teŜ preparatów enzymatycznych.

Połączone systemy UF i RO stosowane do odzyskiwania substancji aromatycznych zawartych w skórkach owoców cytrusowych, w duŜej mierze wpływają na lepszą jakość produktu i wydajność procesu. Ultrafiltrację stosuje się teŜ do pozyskiwania i zagęszczania naturalnych barwników tj. antocyjany i betanina. Zawartość tych składników w roztworach wodnych jest bardzo niska (ok. 0,1 %), a w przewadze występują pektyny, białka i cukry. W tradycyjnym procesie sok lub ekstrakt jest filtrowany, zagęszczany na wyparkach i suszony rozpyłowo. Natomiast juŜ jednokrotna UF pozwala 2-krotnie zwiększyć zawartość barwników a suchej masie.

W produkcji winiarskiej zastosowanie MF i UF moszczów lub gotowego wina zapewnia z jednej strony usunięcie niepoŜądanej mikroflory, zaś z 2 pozbawienie wina związków powodujących jego mętność. W ten sposób eliminuje się z procesu produkcyjnego uciąŜliwe etapy filtracji z uŜyciem środków klarujących oraz siarkowanie, jako czynnik niszczący mikroflorę. Z kolei uŜycie membran RO umoŜliwia częściowe lub całkowite usunięcie alkoholu z wina lub teŜ jego zagęszczenie. Otrzymuje się produkt o bardziej intensywnej barwie i zwiększonej zawartości alkoholu.

Biotechnologia

Biotechnologia, jako szeroka dziedzina, stwarza teŜ bardzo szerokie moŜliwości stosowania technik membranowych. Począwszy od „zimnej” sterylizacji poŜywek przy uŜyciu MF, moduły membranowe są zastosowane w reaktorach z recyrkulacją komórek i ciągłym odbieraniem produktów oraz do separacji i zagęszczania produktów fermentacji. Na rysunku przedstawiono schemat tradycyjnego bioreaktora z dołączonym modułem membranowym i moŜliwością recyrkulacji komórek.

7



Fermentor z recyrkulacją komórek.

Taki układ umoŜliwia ciągłość pracy fermentatora, gdyŜ produkty procesu są w kontrolowany sposób odprowadzane i ich wzrastająca koncentracja nie inhibuje przebiegu prowadzonej reakcji. Dodatkowo teŜ następuje ciągłe zawracanie komórek do reaktora, co zwiększa ich stęŜenie i powoduje tym samym wzrost wydajności procesu. Według podanego obok schematu przeprowadza się produkcję etanolu z surowców skrobiowych i serwatki, a takŜe kwasu mlekowego, octowego i propionowego. Selektywne przegrody o róŜnych konfiguracjach, Z unieruchomionymi komórkami lub enzymami, słuŜą do budowy fermentorów nazywanych reaktorami membranowymi. Reaktory takie mogą być stosowane do prowadzenia fermentacji alkoholowej, mlekowej, octowej oraz do enzymatycznej hydrolizy sacharozy. W fermentacji alkoholowej aplikacją zyskuje proces perwaporacji. Etanol odprowadzany w ten sposób z cieczy fermentacyjnej ma stęŜenie ok. 40 %, a koszt produkcji jest o 29 % niŜszy od produkowanego tradycyjnie.

Fermentacja alkoholowa z ciągłym usuwaniem etanolu za pomocą perwaporacji i recyrkulacją komórek.

Przy uŜyciu PV moŜna teŜ odprowadzać z cieczy fermentacyjnej substancje zapachowe. Opracowana w ostatnich latach membrana 2-polarna, stosowana w elektrodializie, pozwala na otrzymywanie kwasu mlekowego bez konieczności jego oczyszczania, co jest wymagane w tradycyjnych metodach.

Inne zastosowania procesów membranowych.

Techniki membranowe, przede wszystkim UF, stosuje się do zagęszczania białka jaja kurzego. Proces ten stosuje się teŜ do odsalania białka jaja. Pozyskane w ten sposób czyste białko nie róŜni się wskaźnikami jakościowymi od białka negatywnego.

UF stosuje się teŜ w produkcji koncentratów białkowych z roślin oleistych. Dzięki technice membranowej, moŜna usunąć z ekstraktu białkowego niepoŜądane niskocząsteczkowe składniki (przede wszystkim fenole), odpowiedzialne za nieprzyjemny zapach.

Przemysł spoŜywczy stosuje teŜ w niektórych przypadkach techniki membranowe na rzecz OŚ. Znane są przykłady poddawania procesowi MF solanek peklujących, w celu ich wielokrotnego uŜycia, a takŜe przykłady membranowego oczyszczania wód odpadowych.

8



Tlenowe hodowle mikroorganizmów na przykładzie tlenowej hodowli drożdży

Celem ćwiczenia jest:

• zapoznanie się z przebiegiem tlenowej hodowli droŜdŜy

• ocena wykorzystania składników poŜywki podczas hodowli droŜdŜy

• obliczanie bilansu masowego hodowli

WARUNKI HODOWLI DROŻDŻY

Do osiągnięcia właściwego przyrostu biomasy w odpowiednim czasie konieczna jest obecność podstawowych składników poŜywki we właściwych proporcjach. Niezbędne są: woda, źródła węgla i azotu, magnezu, mikroelementów, witamin i innych substancji wzrostowych. DroŜdŜe najlepiej rozwijają się na poŜywkach zawierających cukry proste. Podstawowymi monosacharydami wykorzystywanymi przez droŜdŜe są D-glukoza, D-fruktoza, D-mannoza. Disacharydem powszechnie metabolizowanym w warunkach tlenowych i beztlenowych jest sacharoza. Niektóre gatunki droŜdŜy mają zdolność wykorzystywania laktozy, rafinozy, L-sorbozy, D-ksylozy, L-arabinozy czy celobiozy. Źródłem węgla mogą być takŜe: skrobia rozpuszczalna, pektyna, etanol, metanol, etanodiol, glicerol, niektóre kwasy organiczne i in. Do prawidłowego wzrostu wymagają obecności substancji stymulujących m.in.: biotyny, kwasu pantenowego, mezoinozytu. Bazę podłoŜa do hodowli droŜdŜy stanowi melasa buraczana lub trzcinowa oraz brzeczka słodowa. Optymalne pH poŜywki wynosi 4-5, zawartość wody 30 % min.

Większość gatunków droŜdŜy najszybciej rozmnaŜa się w temperaturach 25-32 °C, chociaŜ występują gatunki, dla których optymalna temperatura wzrostu wynosi 37 (gat. termofilne) lub 20 °C (gat. psychrofilne). NajniŜsza temperatura, w której zaobserwowano rozmnaŜanie się droŜdŜy wynosi 2 °C a najniŜsza 46 °C i wartości te przyjmuje się, jako punkty krytyczne.

Charakterystyka wzrostu mikroorganizmów

Wzrost mikroorganizmów moŜna przedstawić na wykresie zaleŜności logarytmu liczby komórek do czasu hodowli. Powstanie krzywa wzrostu, na której moŜna wyróŜnić 6 podstawowych faz wzrostu: faza wzrostu utajonego, faza początku rozmnaŜania, faza logarytmiczna (wykładnicza), faza wzrostu zwolnionego, faza stacjonarna i faza zamierania.

Faza wzrostu utajonego – okres adaptacji komórek do nowego środowiska. Następuje w niej energetyczna adaptacja do środowiska i uruchomienie mechanizmów umoŜliwiających transportowanie składników poŜywki do wnętrza komórek. Następują syntezy enzymów, białek budujących odpowiednie kanały transportowe itp. Istnieje zasada oszczędności energetycznej, tzn., Ŝe komórka adaptuje swój metabolizm do asymilacji najłatwiej dostępnego źródła węgla. Ilość komórek nie zmienia się tzn. x = x

0

= const.

Efektywność procesów tlenowych zaleŜy od:

- szybkości mieszanie poŜywki - ilość doprowadzenia gazu - temperatura hodowli - stęŜenie substancji rozpuszczalnych - obecność substancji zmniejsza lub zwiększa napięcie powierzchniowe.

Faza początku rozmnażania się komórek (x > x

0

) – opanowanie środowiska jest tym szybsze im większe było inokulum komórkowe. Ilość i szybkość podziałów zaleŜy od warunków hodowli (pH, temperatury, potencjału red-ox, siły jonowej i koncentracji O

2

). W sprzyjających warunkach hodowla przechodzi do fazy 3 faza wzrostu utajonego i faza początku rozmnaŜania są czasami ujmowane w 1 fazę, tzw. lagfazę.

Faza logarytmiczna (wykładnicza) – charakteryzuje się stałym minimalnym czasem generacji a tym samym maksymalną szybkością wzrostu mikroorganicznego. Często wielkość komórek i zawartość w nich białek w tej fazie jest stała, co umoŜliwia stosowanie pośrednich metod pomiaru biomasy. O takiej hodowli mówi się, Ŝe zawiera ona „komórki standardowe”.

· 2 2

gdzie: x

k

– końcowa masa komórek n – ilość podziałów

W tej fazie szybkość wzrostu populacji (μ) jest stała i jest funkcją logarytmiczną:

9



1

t - czas

Faza logarytmiczna trwa tak długo, dopóki nie nastąpi wyczerpanie jakiegoś składnika poŜywki lub dopóki nie wzrośnie stęŜenie toksycznych metabolitów do wartości krytycznej (do pojawienia się czynnika limitującego wzrost). Określa to zaleŜność Monoda:

·

gdzie: μ K

max

s

– – stała maksymalna półnasycenia właściwa (stała szybkość wzrostu

hamowania), czyli stęŜenie substratu, przy którym:

0,5 · S – stęŜenie substratu ograniczającego:

·

gdzie: μ

max

– maksymalna właściwa szybkość wzrostu K

p

– stęŜenie produktu toksycznego, przy którym μ = 0,5 ⋅ μ

max P - stęŜenie produktu toksycznego.

W momencie pojawienia się czynnika ograniczającego następuje zmniejszenie μ i przejście do fazy wzrostu zwolnionego.

Faza wzrostu zwolnionego (właściwa szybkość wzrostu maleje aŜ do momentu, kiedy ilość komórek jest stała) i faza stacjonarna – rozpoczyna się w momencie, gdy komórki nie mogą się juŜ rozmnaŜać. PoniewaŜ szybkość wzrostu zaleŜy m.in. od stęŜenia substratów, (które maleje podczas hodowli), szybkość wzrostu hodowli zaczyna się zmniejszać jeszcze przed całkowitym wyczerpaniem substratu. Dlatego przejście od fazy logarytmicznej do stacjonarnej jest zazwyczaj stopniowe. Poza ograniczeniem ilości substratu. TakŜe inne czynniki, tj. duŜa gęstość populacji, niskie ciśnienie parcjalne tlenu czy nagromadzenie toksycznych produktów metabolizmu (np. etanol dla droŜdŜy), mogą prowadzić do spowolnienia szybkości wzrostu i zainicjowania fazy stacjonarnej.

W wielu produkcyjnych procesach biotechnologicznych nastawionych na wytwarzanie wtórnych metabolitów (np. produkcja penicyliny) faza stacjonarna jest główną fazą produkcyjną. Dlatego w biotechnologii rozróŜnia się trofofazę, czyli fazę wzrostu i idiofazę – fazę produkcji. Mimo, Ŝe w idiofazie komórki juŜ nie rosną, potrafią one wykorzystywać podawany substrat oraz włączać związki prekursorowe do produktu końcowego.

Faza zamierania – po pewnym czasie hodowli komórki zaczynają zamierać. Często przyczyną jest nagromadzenie w poŜywce hodowlanej toksycznych metabolitów. W niektórych wypadkach następuje liza (autoliza) komórek wskutek działania wydzielanych przez mikroorganizmy do podłoŜa enzymów.

PARAMETRY CHARAKTERYZUJĄCE WZROST KOMÓREK

*właściwa szybkość wzrostu:

X

k

– końcowe stęŜenie komórek X

0

– początkowe stęŜenie komórek

*czas generacji:

10

·

MIKROBIOLOGIA laboratorium 8_Analiza mikrobiologiczna wody do celów sanitarnych.doc

Podgląd pliku (pełna wersja wyższej jakości po zalogowaniu):
Analiza mikrobiologiczna wody do celów sanitarnych

TEMAT 8: Analiza mikrobiologiczna wody


Literatura uzupełniająca:

A. Grabińska-Łoniewska „Ćwiczenia laboratoryjne z mikrobiologii ogólnej” str. 117 – 129


Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien:

  • Wiedzieć, jakie są przyczyny skażenia wód i dlaczego kontrolujemy ich jakość mikrobiologiczną.

  • Znać poszczególne organizmy wskaźnikowe wykorzystywane w analizie mikrobiologicznej wody i umieć scharakteryzować ich podstawowe cechy.

  • Znać kryteria bakteriologiczne, jakim powinna odpowiadać woda do picia w Polsce.

  • Umieć oznaczyć liczebność organizmów wskaźnikowych w próbie wody i znać podstawowe pojęcia stosowane przy określaniu zanieczyszczenia mikrobiologicznego wody (np. NPL)


Dlaczego kontrolujemy jakość sanitarną wody?

Możliwość zakażenia ludzi przez wodę zmusza do stałej kontroli higieniczno-sanitarnej, zarówno wody przeznaczonej do picia, jak też i wody w basenach kąpielowych, a nawet w zbiornikach wód powierzchniowych. Przyczyną zakażeń są mikroorganizmy chorobotwórcze wydalane przez ludzi chorych i nosicieli (osobnicy, którzy po przebyciu choroby wydalają zarazki jeszcze przez długi czas z kałem lub moczem). Zarazki występują w ściekach i w wodach powierzchniowych w znacznie mniejszych ilościach niż pozostałe drobnoustroje. Z tego też względu znacznie trudniej jest je wykryć niż występujące masowo w wodzie bakterie saprofityczne, tym bardziej, że w celu ich wykrycia konieczne jest stosowanie znacznie bardziej skomplikowanych metod diagnostycznych.


Co to są mikroorganizmy wskaźnikowe?

Obowiązujące normy oparte są na pośrednim wnioskowaniu o obecności mikroorganizmów chorobotwórczych na podstawie liczebności w wodzie bakterii wskaźnikowych, które stale żyją jako saprofity w przewodzie pokarmowym człowieka i zwierząt wyższych. Ich obecność w wodzie świadczy o jej zanieczyszczeniu fekalnym, a zatem również o niebezpieczeństwie zakażenia wody mikroorganizmami chorobotwórczymi.


Bakterie pełniące rolę wskaźników sanitarnych powinny spełniać następujące warunki:

  • muszą być stale obecne w przewodzie pokarmowym człowieka, co pozwala zawsze na wykrycie kałowego zanieczyszczenia wody

  • do grupy organizmów wskaźnikowych powinny należeć także formy nie przetrwalnikujące, co umożliwia wykrycie świeżego fekalnego zanieczyszczenia wody

  • ich identyfikacja musi być możliwa przy użyciu łatwo dostępnych metod

  • długość życia bakterii wskaźnikowych w środowisku zewnętrznym musi być większa niż długość życia gatunków chorobotwórczych

  • liczebność bakterii wskaźnikowych w jelicie człowieka i kale powinna być duża

  • nie powinny się one rozmnażać w środowisku wodnym.


Jakie bakterie wskaźnikowe wykorzystywane są do oceny jakości zdrowotnej wody?

W rutynowej pracy laboratoriów, prowadzących nadzór sanitarno - epidemiologiczny, niemożliwe jest stałe badanie wody w kierunku wykrywania wszystkich drobnoustrojów chorobotwórczych i potencjalnie chorobotwórczych, które mogą w niej występować. Dlatego też badania rutynowe koncentrują się przede wszystkim na wykrywaniu bakterii wskazujących na kałowe zanieczyszczenie wody. Do oceny jakości sanitarnej wody wykorzystywana jest mikroflora saprofityczna zasiedlająca jelito grube człowieka. Przyjęto następujące wskaźniki fekalnego zanieczyszczenia wody:

  • -Escherichia coli

  • -bakterie grupy coli,

  • -paciorkowce kałowe (Enterokoki),

  • -laseczki z rodzaju Clostridium ( Clostridium perfringens), redukujące siarczyny

oraz w niektórych przypadkach

  • gronkowce koagulazo-dodatnie

  • Pseudomonas aeruginosa

  • Legionella sp.


Pałeczka okrężnicy (Escherichia coli)

Fakultatywnie tlenowa, Gram-ujemna pałeczka należąca do rodziny Enterobacteriaceae. Wchodzi w skład fizjologicznej flory bakteryjnej jelita grubego człowieka oraz zwierząt stałocieplnych. W jelicie spełnia pożyteczną rolę, uczestnicząc w rozkładzie pokarmu, a także przyczyniając się do produkcji witamin z grupy B, C oraz K. E. coli spotyka się również w glebie i wodzie, gdzie trafiają z wydzielinami i kałem. Bakterie te, zwykle nieszkodliwe w jelicie, mogą jednak powodować groźne schorzenia przewodu pokarmowego, dróg moczowych, a ostatnio często dróg oddechowych.



Bakterie z grupy coli

Bakterie grupy coli to przede wszystkim szczepy Escherichia coli oraz drobnoustroje z rodzaju Enterobacter, Citrobacter i Klebsiella. Wykrywane są one na podłożach z laktozą po inkubacji w temperaturze 37 oC.

Bakterie grupy coli typu kałowego (termotolerancyjne) to głównie szczepy Escherichia coli i tylko te nieliczne szczepy z rodzajów Enterobacter, Citrobacter i Klebsiella, które mają zdolność fermentacji laktozy w temperaturze 44 oC.

Obecność w badanej próbce wody bakterii grupy coli lub bakterii grupy coli typu kałowego świadczy o stosunkowo świeżym zanieczyszczeniu wody kałem, ściekami, glebą lub gnijącym materiałem roślinnym. W zasadzie dla większości rodzajów wód zalecane jest oznaczanie liczby bakterii obu grup coli.

Paciorkowce kałowe

Paciorkowce kałowe to grupa bakterii kulistych lub owalnych, występujących w postaci komórek pojedynczych, dwoinek lub krótkich łańcuszków. Obejmuje ona drobnoustroje z rodzajów: Enterococcus i Streptococcus należące do grupy serologicznej Lancefield D, m. in. Streptococcus faecalis, S. faecium, S. equinus i S. bovis. Występują one powszechnie w kale ludzi i zwierząt. Stwierdzenie obecności paciorkowców kałowych w badanej próbie świadczy o jej kontakcie z zanieczyszczeniami typu kałowego, podobnie jak obecność bakterii grupy coli. Występowanie enterokoków w liczbie znacznie przewyższającej liczbę bakterii grupy coli, sugerować może zanieczyszczenie wody kałem zwierzęcym lub ściekami, pochodzącymi z ferm hodowlanych. Paciorkowce fekalne na ogół charakteryzuje dłuższa przeżywalność w wodzie oraz większa odporność na działanie chloru niż bakterie grupy coli.

Najważniejsze cechy charakterystyczne tej grupy bakterii to:

- zdolność wzrostu w temperaturze 45oC, w obecności 40% żółci oraz obecności azydku sodowego;

- zdolność wzrostu w temperaturze 10oC ( z wyjątkiem S. bovis i S. equinus) przy pH 9,6, w

obecności 6,5% chlorku sodowego;

- ujemny test na katalazę oraz barwienie dodatnie w metodzie Grama.

Laseczki z rodzaju Clostridium

O starym, odległym w czasie zanieczyszczeniu kałowym może świadczyć wykrycie w badanej próbce wody bakterii redukujących siarczyny (głównie szczepy Clostridium perfringens); ich przetrwalniki mogą zachować żywotność przez wiele lat w niesprzyjających warunkach. Clostridia redukujące siarczyny są też bardzo dobrym wskaźnikiem prawidłowości prowadzonych procesów uzdatniania wody, takich jak koagulacja, sedymentacja i filtracja. Przetrwalniki tych bakterii, a wraz z nimi również cysty pasożytniczych pierwotniaków (Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia) powinny być wyeliminowane właśnie w tych etapach uzdatniania wody, gdyż są one bardzo oporne na działanie środków dezynfekcyjnych. Wykrycie bakterii z rodzaju Clostridium jest technicznie znacznie bardziej proste od poszukiwania pierwotniaków pasożytniczych i daje dużą pewność, że woda uzdatniona jest wolna od pierwotniaków i jaj robaków chorobotwórczych (helmintów).

Pseudomonas aeruginosa

Obok wymienionych elementów analizy sanitarnej proponuje się obecnie dodatkowo wykrywanie bakterii z gatunku Pseudomonas aeruginosa w wodzie do picia i na potrzeby gospodarcze a także w wodzie dla zakładów kąpielowych oraz w wodach powierzchniowych. Przedstawicieli tego gatunku wyizolowano z kału ludzkiego oraz w przypadkach zakażeń organizmu – z dróg moczowych, ucha środkowego, ropiejących ran itp. Bakterie te stanowią potencjalny czynnik chorobotwórczy dla ludzi i zwierząt. Poza tym występują one powszechnie w wodach powierzchniowych i glebie. Warto także podkreślić, że mogą one bytować w chlorowanej wodzie, gdyż odznaczają się znaczną odpornością na zabiegi dezynfekcyjne.

Bakterie z rodzaju Legionella

Bakterie z rodzaju Legionella są to Gram ujemne pałeczki posiadające polarnie umieszczone wici w liczbie od 1 do 3. Do wzrostu potrzebują żelaza i cysteiny. Ich naturalnym rezerwuarem są wody śródlądowe i morskie. Licznie występują również w glebie i gorących źródłach wody. Wyizolowano do tej pory 46 gatunków z rodzaju Legionella, wśród których zidentyfikowano 70 grup serologicznych. Bakterie z rodzaju Legionella są wewnątrzkomórkowymi pasożytami pierwotniaków. Mogą również powodować nietypowe zapalenie płuc u ludzi, jak i gorączkę Pontiac. Szczególnie niebezpieczne dla człowieka są bakterie należące do gatunku Legionella pneumophila. Dostają się one do płuc w mikroaerozolach o średnicy 2,0 – 5,0 µm powstających np. w kabinach prysznicowych. Postaci płucnej legionellozy towarzyszy suchy kaszel, zaburzenia w oddychaniu, temperatura powyżej 40°C, zaburzenia świadomości. Śmiertelność wynosi 10-20% zachorowań. Rezerwuarem tych bakterii są systemy ciepłej wody i urządzenia wentylacyjne. Bakterie te mogą kolonizować wewnętrzne części rur z ciepłą wodą, zbiorniki na ciepłą wodę, wieże chłodnicze, perlatory zaworów czerpalnych (głowice natryskowe pryszniców).

Ogólna liczebność bakterii

W badaniach rutynowych określa się również ogólną liczbę bakterii, jako liczbę jednostek tworzących kolonie, w skrócie j.t.k.(odpowiednik angielski: cfu - colony forming units) obecnych w 1 ml wody, po wykonaniu posiewu próbki na agar odżywczy i inkubacji w temperaturach 22±2oC przez 72 godz. (psychrofile), oraz w 36±2oC przez 24 godz. (mezofile).


Ogólna liczebność bakterii psychrofilnych

W niższej temperaturze rosną przede wszystkim nie chorobotwórcze bakterie wodne. Należy jednak mieć na uwadze fakt, że Gram-ujemne bakterie wodne wytwarzają lipopolisachardy ściany komórkowej mogące działać toksycznie – tak jak endotoksyny bakterii chorobotwórczych. Z tego powodu ich liczba powinna być także monitorowana. Ponadnormatywny wzrost ich liczebności świadczyć może między innymi, o obecności w wodzie łatwo przyswajalnych związków organicznych. Teoretycznie, obecność w wodzie 0,1 mg węgla organicznego może spowodować wzrost liczby bakterii w 1 ml do 108 j.t.k. (cfu). Również fosfor jest czynnikiem stymulującym wzrost drobnoustrojów. Dodanie niewielkiej ilości tego pierwiastka (<50mg/l) powoduje nawet 10-krotne przyspieszanie rozwoju bakterii w wodociągach.


Ogólna liczebność bakterii mezofilnych

Ze względów zdrowotnych, bardziej niebezpieczna jest ponadnormatywna liczba bakterii rosnących w temperaturze 37oC, ponieważ mogą wśród nich być również bakterie chorobotwórcze. Duża ich liczba w badanej próbce wody, może świadczyć, między innymi, o źle przebiegających procesach uzdatniania lub zasysaniu zanieczyszczonej wody.

Co może być powodem zwiększenia ogólnej liczby bakterii w wodzie?

Zwiększenie ogólnej liczby bakterii obecnych w próbce wody może świadczyć o namnażaniu się drobnoustrojów na wewnętrznych powierzchniach instalacji wodnych, szczególnie na złączach rur i uszczelkach oraz tworzeniu się warstwy tzw. biofilmu. Przekroczenie dopuszczanego poziomu ogólnej liczby bakterii powinno być zawsze sygnałem do znalezienia przyczyny zanieczyszczenia i do podjęcia odpowiedniego postępowania. Niekiedy może istnieć konieczność dodatkowego chlorowania, np. wody do picia, powyżej 0,2 mg Cl2/l. W niektórych przypadkach dopiero zmiany konstrukcyjne sieci wodociągowej i usunięcie biofilmu są w stanie skutecznie zabezpieczyć odbiorcę przed wzrostem liczebności drobnoustrojów w wodzie.

Kryteria jakości sanitarnej wody do picia w Polsce.

Jakość bakteriologiczna wody do picia w Polsce oceniana jest na podstawie liczebności dwóch grup bakterii wskaźnikowych: Escherichia coli i enterokoków (tabela 1). Dodatkowo dokonuje się analizy bakterii z grupy coli oraz klostridiów redukujących siarczyny (tabela 2).Według stosowanych w Polsce kryteriów w 100 ml wody podawanej do sieci wodociągowej nie może być ani jednej komórki bakterii uznanych za wskaźnikowe. Podobne normy jakości wody obowiązują w Unii Europejskiej. Dodatkowym ważnym kryterium jakości wody do picia jest także ogólna liczebność bakterii psychrofilnych i mezofilnych w 1 ml wody. Według stosowanych w Polsce kryteriów w wodzie do spożycia przez ludzi liczebność bakterii psychrofilnych nie powinna przekraczać 100 komórek w 1ml, natomiast bakterii mezofilnych 50 komórek w 1 ml wody (tabela 2).

Osobne wymagania dotyczą wód wprowadzanych do jednostkowych opakowań (tabela 3) oraz wód w cysternach, zbiornikach magazynujących wodę w środkach transportu lądowego, powietrznego lub wodnego (tabela 4). Jakość wody ciepłej ocenia się na podstawie liczebności bakterii z rodzaju Legionella (tabela 5).

Tabela 1. Podstawowe wymagania mikrobiologiczne, jakim powinna odpowiadać woda do picia

Lp.

Parametr

Najwyższa dopuszczalna wartość

Liczba mikroorganizmów [jtk]

Objętość próbki

[ml]

1

Escherichia coli

0

100

2

Enterokoki

0

100


Tabela 2. Dodatkowe wymagania mikrobiologiczne, jakim powinna odpowiadać woda do picia

Lp.

Parametr

Najwyższa dopuszczalna wartość parametru w próbce wody

Liczba mikroorganizmów [jtk]

Objętość próbki

[ml]

1

Bakterie grupy coli1

0

100

4

Ogółna liczba mikroorganizmów w 36±2oC po 48 h

50

1


Ogółna liczba mikroorganizmów w 22±2oC po 72 h

100

1

5

Clostridium perfringens2

0

100


Tabela 3. Wymagania mikrobiologiczne, jakim powinna odpowiadać woda wprowadzana do

opakowań jednostkowych.

Lp.

Parametr

Najwyższa dopuszczalna wartość

Liczba mikroorganizmów [jtk]

Objętość próbki

[ml]

1

Escherichia coli

0

250

2

Enterokoki

0

250

3

Pseudomonas aeruginosa

0

250

4

Ogółna liczba mikroorganizmów w 36±2oC po 48 h

20

1

5

Ogółna liczba mikroorganizmów w 22±2oC po 72 h

100

1


Tabela 4. Wymagania mikrobiologiczne, jakim powinna odpowiadać woda w cysternach, zbiornikach magazynujących wodę w środkach transportu lądowego, powietrznego lub wodnego.


Lp.

Parametr

Najwyższa dopuszczalna wartość parametru w próbce wody pobranej

Liczba mikroorganizmów [jtk]

Objętość próbki

[ml]

1

Escherichia coli

0

100

2

Enterokoki

0

100

3

Pseudomonas aeruginosa

0

100

4

Ogółna liczba mikroorganizmów w 36±2oC po 48 h

100

1


Tabela 5. Wymagania mikrobiologiczne, jakim powinna odpowiadać ciepła woda użytkowa

Lp.

Parametr

Najwyższa dopuszczalna wartość

Liczba mikroorganizmów [jtk]

Objętość próbki

[ml]

1

Legionella sp.3

<100

100


















CZĘŚĆ PRAKTYCZNA

Zadanie1. Oznaczanie bakterii grupy coli metodą filtrów membranowych (FM)

Metodę tę stosuje się do wykrywania bakterii grupy coli w wodzie wodociągowej uzdatnionej i nieuzdatnionej. Metody nie należy stosować do oznaczania liczby bakterii coli w wodach powierzchniowych o mętności wyższej niż 20 mg SiO2/dm3, przy równocześnie niskiej liczbie bakterii grupy coli, tj. poniżej 10 kolonii w 100 cm3 wody, a wysokiej liczbie (powyżej 100 komórek/cm3) bakterii wodnych mogących rozwinąć się również na zastosowanym podłożu. Metoda ta nie nadaje się do oznaczania liczby bakteri coli w ściekach. W tych przypadkach należy wykonać oznaczenia metodą fermentacyjno-probówkową (FP).

Zasada metody:

Oznaczanie liczby bakterii grupy coli metodą filtrów membranowych przez określenie tzw. wskaźnika coli jako wyniku ostatecznego polega na przesączeniu przez filtr membranowy odpowiednio dobranej objętości próbki wody. Bakterie zatrzymane na filtrze umieszczonym następnie na pożywce wybiórczej dyfundującej przez pory filtru, rozwijają się w czasie inkubacji, tworząc kolonie o typowym wyglądzie. Założono, że z jednej komórki bakteryjnej rozwija się jedna kolonia. Przez obliczenie typowych kolonii bakterii należących do grupy coli określa się następnie wskaźnik coli jako liczbę komórek bakterii grupy coli w 100 cm3 próbki wody.

Objętość próbki nie powinna być mniejsza niż 250 cm3. Przed użyciem aparat filtracyjny należy wysterylizować w autoklawie w temp. 120oC przez 15 min. Filtry membranowe (o średnicy ok. 50 mm i przeciętnej średnicy porów 0,45 μm) wysterylizować w przez dwukrotne wygotowanie w wodzie destylowanej, każdorazowo zmienianej – w ciągu 20 min.

Sposób postępowania:

1. Zmontować aparat filtracyjny. W tym celu lejek umieścić w kolbie ssawkowej, połączonej z pompą

próżniową. Przy zamkniętym kranie aparatu nałożyć pincetą (wyjałowioną przez opalanie) filtr

membranowy na porowatą płytkę, błyszczącą względnie kratkowaną stroną do góry,

2. Wlać odpowiednią ilość badanej wody do lejka, otworzyć kran i przefiltrować próbkę. Objetość próbki

użytej do filtracji powinna wynosić odpowiednio:

- dla wody wodociągowej - 200 cm3;

-dla wody powierzchniowej i wody z basenu kąpielowego – 1 i 0,1 cm3;

Całkowita objętość filtrowanej wody nie powinna być mniejsza niż 20 cm3.

3. Po przefiltrowaniu, ściany lejka spłukać dokładnie jałową wodą buforowaną;

4. Zamknąć kran i wyjałowioną pincetą przenieść filtr membranowy na powierzchnię podłoża agarowego

Endo FM. Filtr powinien być położony do góry zawiesiną bakteryjną tak, aby nie było pęcherzyków

powietrza pomiędzy filtrem a podłożem;

5. Płytki Petriego z filtrami umieścić w cieplarce dnem ku górze i inkubować w temp. 37oC w ciągu 20

godz. Okres inkubacji należy przedłużyć do 48 godz. w przypadku braku wzrostu po 20 godzinach

lub wzrostu nielicznych, nietypowych kolonii.

6. Po inkubacji policzyć wyrosłe kolonie typowe, tj. ciemnoczerwone z metalicznym, połyskiem

(tzw. połysk fuksynowy).

Do liczenia należy wybrać filtry, na których jest od 20 do 80 kolonii typowych, a ogólna liczba kolonii nie przekracza 200. Jeśli po 20 godz. nie stwierdza się obecności typowych kolonii, natomiast wyrosły kolonie czerwone, różowe z ciemnym środkiem i różowe, należy przeprowadzić badanie potwierdzające. Badania te należy również zastosować przy pojawieniu się kolonii z metalicznym połyskiem po przedłużonym okresie inkubacji. W tym celu od 3-6 kolonii z filtrów należy przeszczepić na podłoże laktozowe z purpurą bromokrezolowąi inkubować w temp. 37oC w ciągu 24-48 godz. Pojawienie się gazu w rurce Durhama oraz zmiana zabarwienia podłoża na żółte świadczy o dodatnim wyniku badania potwierdzającego. W przypadku ujemnego wyniku na podłożu laktozowym, należy przeprowadzić badanie potwierdzające, jak w etapie II metody fermentacyjno-probówkowej (FP).


Zadanie 2. Oznaczanie Escherichia coli (bakterii grupy coli typu kałowego)

metodą filtrów membranowych (FM)


Badanie wstępne wykonać zgodnie z metodyką podaną przy oznaczaniu bakterii grupy coli (zadanie 1). Inkubację hodowli na podłożu agarowym Endo FM prowadzić w temp. 44oC przez 24 godz.;

W razie konieczności wykonania badania potwierdzającego, materiał z kolonii należy wyizolować na skos agarowy, a nastepnie wykonac barwienie metodą Grama oraz sprawdzić zdolność do wytwarzania oksydazy cytochromowej i fermentowania laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu na pożywce ze wskaźnikiem Andrade lub na pożywce z zielenią brylantową w temp.44oC w ciągu 24 godz.

Obliczanie wyniku oznaczania

Wynik badania należy podać w jednostkach tworzących kolonie (jtk)/ 100 cm3 (wskaźnik coli)

korzystając ze wzoru:

X = a x 100/V

gdzie: X – wskaźnik coli,

a – liczba typowych kolonii,

V – objętość filtrowanej wody [cm3].

Ostateczny wynik stanowi średnią arytmetyczną, z co najmniej dwóch filtracji różnych objętości wody. Na podstawie wartości wskaźnika można obliczyć miano coli lub miano coli typu kałowego

(E. coli) wg wzoru:

miano coli = 100/X

gdzie: X – wskaźnik coli


Zadanie 3. Oznaczanie paciorkowców kałowych (Streptococcus faecalis)

metodą filtrów membranowych (FM)


Metodę FM do oznaczania paciorkowców kałowych stosuje się do wszystkich wód, z wyjątkiem wód o dużej zawartości zawiesiny.

Oznaczenie paciorkowców kałowych polega na przesączeniu określonej objętości próbki przez filtr membranowy i przeniesieniu filtru z bakteriami na pożywkę Slanetza i Bartleya (SB) z azydkiem sodu. Paciorkowce rozwijają się na tej pożywce tworząc charakterystyczne kolonie zabarwione na kolor czerwony i różowy;

Postępowanie:

1. Przefiltrować wodę jakw zadaniu 1 i 2

2. Po filtracji (warunki sterylne), jałową pincetą przenieśc filtr membranowy na pożywkę SB

i wstawić do cieplarki o temperaturze 37oC na 48 h

3. Po inkubacji policzyć wyrosłe kolonie. Ze względu na niewielkie rozmiary kolonii (0,2 do 1 mm

średnicy), zaleca się liczyć je pod lupą. Liczba wyrosłych kolonii nie powinna być większa niż 100

i nie mniejsza niż 20, dlatego zaleca się wykonanie rozcieńczeń badanej próbki.

Obliczanie wyniku oznaczania:

liczbę paciorkowców kałowych (X) obliczyć wg wzoru:

X = a x 100/V

a – liczba typowych kolonii na pożywce SB,

V – objętość filtrowanej wody [cm3]

Wynik należy podać jako jtk /100 cm3 próbki









Zadanie 4. Oznaczanie liczby bakterii psychrofilnych i mezofilnych

1. Oznaczanie wykonać metodą płytkową Kocha, stosując posiew wgłębny na podłoże agarowe odżywcze. Posiewy wody wodociągowej wykonać z prób nierozcieńczonych (1 cm3) oraz z rozcieńczenia 10-1 (1 cm3);

2. Inkubację bakterii psychrofilnych prowadzić w temp. 20oC w ciągu 72 godzin, a mezofilnych – w temp. 37oC przez 24 h;

3. Po okresie inkubacji policzyć wyrosłe kolonie. Do określenia liczby kolonii, przy posiewie wody powierzchniowej i ścieków, wybrać płytki,na których wyrosło od 30 – 300 kolonii. W przypadku, gdy liczba kolonii wyrosłych na płytce jest większa niż 300 oznaczenie należy wykonać ponownie. Licząc kolonie z próby rozcieńczonej, należy liczbę koloni pomnożyć przez krotność rozcieńczenia;

4. Wynik oznaczenia podać jako jtk/1 cm3


Zadanie 5. Oznaczanie NPL i miana bakterii z grupy coli metodą fermentacyjno-probówkową (FP)

Określenia:

  • bakterie grupy coliGram – ujemne pałeczki nie wytwarzające przetrwalników, rozwijające się w warunkach wzglądnie beztlenowych, mające zdolność fermentowania laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu w ciągu 48 h hodowania w temperaturze 37oC. Należą one do rodzaju Escherichia, Citrobacter i Enetrobacter w obrębie rodziny Enterobacteriaceae;

  • najbardziej prawdopodobna liczba bakterii grupy coli (NPL) liczba bakterii grupy coli w 100 cm3 badanej próbki wody lub ścieków określona (z tablic) na podstawie rachunku prawdopodobieństwa;

  • miano coli – najmniejsza objętość badanej wody lub ścieków, wyrażona w cm3, w której stwierdza się jeszcze obecność bakterii grupy coli;

  • wynik dodatni fałszywy - wytworzenie kwasu i gazu w pożywce płynnej z laktozą na drodze fermentacji laktozy, wywołanej przez bakterie nie należące do grupy coli (ani do Enterobacteriaceae), mianowicie przez Gram – dodatnie, wytwarzające prztrwalniki laseczki z rodzaju Bacillus lub przez Gram – ujemne, niewytwarzające przetrwalników pałeczki rodzaju Aeromonas, lub w rezultacie synergizmu bakteryjnego.





Wykrywanie bakterii grupy coli matodą fermentacyjno – probówkową (FP) oparte jest na zdolności tych bakterii do fermentowania laktozy z wytworzeniem w podłożu kwasu oraz widocznego gazu.

Metoda obejmuje badanie wtępne, w którym na podstawie wytworzonego w podłożu kwasu i gazu w ciagu 24 h lub 48 h inkubacji w temperaturze 37oC, wnioskuje się o obecności bakterii z grupy coli (dodatni wynik badania wstępnego) oraz badania potwierdzające, mające na celu wykluczenie fałszywych dodatnich wyników badania wstępnego przez stwierdzenie, że bakterie fermentujące laktozę w badaniu wstępnym rzeczywiście należą do grupy coli. Po wykonaniu badania określa się ostateczny wynik w postaci najbardziej prawdopodobnej liczby (NPL) bakterii grupy coli w 100 cm3 próbki lub miana coli korzystając ze specjalnych tablic statystycznych.

Etap I – Badanie wstępne.

Polega ono na posiewie na podłoże płynne z laktozą i purpurą bromokrezolową (podłoże LPB, podłoże Eijkamana) i inkubacji w temperaturze 37oC przez 48 h. Przed posiewem należy sprawdzić probówki (butelki) z pożywką i odrzucić te, w których stwierdza się obecność pęcherzyka powietrza w probówce Durhama. Wszystkie naczynia z pożywką należy odpowiednio oznakować, podając nr. probówki, datę i ewentualną posiewaną objętość próbki.

Objętość posiewanej próbki uzależniona jest od jej rodzaju, celu badania i wymagań sanitarnych.

Tabela 6. System posiewu próbek wody

Dopuszczalna liczba bakterii

grupy coli w 100 cm3 próbki (NPL)

Objętość posiewanej wody

1

2

10

1 x 50 cm3 i 5 x 10 cm3

5 x 10 cm3, 1 x 1 cm3, 1 x 0,1 cm3

2 x 10 cm3, 2 x 1 cm3, 2 x 0,1 cm3


W przypadku spodziewanego większego zanieczyszczenia wody, należy dodatkowo posiać odpowiednio mniejsze jej objętości, niż w podanym zestawieniu.

Z uwagi na powyższe zależności, należy zastosować następujący sysytem posiewów (tab.7):


Tabela 7. System posiewu próbek wody

Rodzaj próbki

System posiewów

woda z wodociągów sieciowych dezynfekowana

1 x 50 cm3, 5 x 10 cm3

woda z wodociągów sieciowych nie dezynfekowana, woda z basenu kąpielowego

5 x 10 cm3, 1 x 1 cm3,

1 x 0,1 cm3 (rozc. 10-1)

woda z urządzeń na potrzeby własne

2 x 10 cm3, 2 x 1 cm3, 2 x 0,1 cm3

woda powierzchniowa i ścieki po biologicznym oczyszczaniu

2 x 0,1 cm3 – 0,0001 cm3

(rozc. 10-1 – 10-4)


  • posiewy 10 i 50 cm3 nie rozcieńczonej próbki wody należy wykonać na podłoże LPB o stężeniu podwójnym, wszystkie inne objętości, tj. 1 cm3 oraz po 1 cm3 z rozcieńczeń od 10-1 do 10-4 – na podłoże o stężeniu normalnym;

  • posiane próbki inkubować w temp. 37oC w ciągu 24-48 h;

  • za wynik dodatni przyjmuje się obecność gazu w rurkach Durhama lub występowanie pęcherzyków gazu w podłożu, przy lekkim wstrząsaniu, oraz zmętnienie i zmianę barwy z fioletowej na żółtą. Zmiany te wskazują na wzrost bakterii i fermentację laktozy z wytworzniem kwasu i gazu. Jeśli po 18 – 24 h hodowli nie występują zmiany dodatnie próbki, inkubować dalej i wyniki odczytać ponownie po 48 h. Brak gazu i zakwaszenia po 48 h inkubacji przyjmuje się jako wynik ujemny. Obećność niewielkich ilości gazu przy słabym zakwaszeniu lub jego braku, uznaje się za wątpliwy, wymagający dalszego potwierdzenia.


Etap II – Badanie potwierdzające

Badanie to wykonuje się w celu potwierdzenia obecności bakterii grupy coli, w zasadzie z wszystkich dodatnich i wątpliwych hodowli badania wstępnego, uzyskanych po 24 lub 48 h. Badania potwierdzające mają także na celu wykluczenie tzw. wyników dodatnich fałszywych.

Badania potwierdzające obecność bakterii grupy coli wykonuje się na pożywce Endo.

1. Posiać metodą powierzchniową za pomocą ezy niewielką ilość zawiesiny z 24- lub 48-

godzinnej hodowli bakterii na podłożu (LPB) na podsuszone podłoże Endo;

2. Inkubować hodowlę w temp. 37oC w ciągu 24 h;

Za wynik dodatni przyjmuje się wzrost koloni gładkich, ciemnoczerwonych z charakterystycznym metalicznym połyskiem (fuksynowym). W podłożu Endo, w obecności siarczynu sodu, laktoza i fuksyna tworzą leukozwiązek. W wyniku wzrostu bakterii wykorzystujących laktozę następuje uwalnianie fuksyny do podłoża, która barwi charakterystycznie bakterie wystepujące w kolonii. W przypadku obecności choćby jednej takiej kolonii, wynik badania potwierdzającego należy uznać za dodatni. Niektóre szczepy bakterii grupy coli rosną na podłożu Endo w postaci gładkich, jasno- lub ciemnoróżowych koloni bez charakterystycznego połysku. Są to kolonie nietypowe. Obecność na płytce wyłącznie kolonii nietypowych uznaje się za wynik wątpliwy, wymagający uzupełniającego badania potwierdzającego. Wzrost innych kolonii uznaje się za wynik ujemny.


Etap III – Badanie uzupełnijące

Jest to dalszy etap badania potwierdzającego i stosuje się je w przypadku, gdy na pożywce Endo wyrosną nietypowe bakterie, podejrzane o przynależność do grupy coli. Badania obejmują:

  • określenie zdolności wyizolowanego szczepu do fermentacji laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu (tzw. wtórna fermentacja laktozy);

  • wykonanie barwienia metodą Grama;

  • obserwacje mikroskopowe;

  • wykonanie testu na obecność oksydazy cytochromowej.


W celu wykonania badań uzupełniających należy:

1. Wybrać z hodowli na podłożu Endo kilka kolonii nietypowych i każdą posiać na podłoże

laktozowe ze wskaźnikiem Andrade i na powierzchnię skosu z podłoża agarowego (MPA).

2. Hodowle inkubować w temp. 37oC w ciągu 24-48 h;

Za wynik dodatni fermentacji laktozy przyjmuje się zakwaszenie podłoża obrazowane zabarwieniem różowym i obecność gazu w rurkach Durhama. Brak tych zmian jest wynikiem ujemnym badań uzupełniających;

  • barwienie metodą Grama wykonać zgodnie z metodyką, z 24-godzinnych hodowli bakterii na skosie agarowym. Za wynik dodatni przyjąć obecność w preparacie pałeczek Gram (-);

  • test na obecność oksydazy cytochromowej wykonać z zastosowaniem 24-godzinnej hodowli bakterii na skosie agarowym, według metodyki. Za wynik dodatni testu przyjąć brak oksydazy cytochromowej.


Oliczanie NPL wg. tablicy statystycznej (będzie dostępna na ćwiczeniach, są też zamieszczone np. w Ćwiczeniach laboratoryjnych z mikrobiologii ogólnej A. Grabińskiej-Łoniewskiej).

W przypadku posiewania mniejszych objętości próbki niż podano w tej tablicy, z posianych objętości wybiera się trzy objętości stanowiące podstawę dla obliczenia NPL (przy zastosowaniu dwuprobówkowego systemu posiewów). Przy obliczaniu wartości NPL stosuje się następujące zasady:

  • jeśli zamiast 10, 1 i 0,1 cm3 posiewa się 1, 0,1 i 0,01 cm3, otrzymany wynik z tabeli należy zwiekszyć dziesięciokrotnie;

  • jeśli zamiast 10 i 0,1 cm3 posiewa się 0,1, 0,01 i 0,001 cm3, wynik należy zwiększyć

stukrotnie, itd.;

  • jeżeli posiewa się więcej niż trzy różne objętości próbki w rozcieńczeniach dziesięciokrotnych (np. wody powierzchniowe, ścieki), tylko wyniki z trzech wybranych objętości stanowią podstawę do obliczenia NPL.

  • wybór odpowiednich objętości opiera się na zasadzie : jako pierwszą najwiekszą objętość, należy wybrać taką, w której występują tylko wyniki dodatnie przeprowadzonego badania i powyżej której również występuja wyniki dodatnie, pozostałe dwie objętości, to dwa następne, kolejne rozcieńczenia próbki;

  • do określenia miana coli w przypadku posiewania wiecej niż trzech objętości próbki lub mniejszych objętości niż podano w tabeli, należy posługiwać się również tą samą tablicą w sposób analogiczny jak przy określaniu NPL z tym, że wyniki miana otrzymane z tabeli należy zmniejszyć, np. jeśli zamiast 10, 1 i 0,1 cm3, posiewa się 1, 0,1 i 0,001 cm3, odczytaną wartość miana należy dziesięciokrotnie zmniejszyć.


Zadanie 6. Oznaczenie NPL i miana Escherichia coli (bakterii grupy coli typu kałowego)

metodą fermentacyjno probówkową (FP)

Metodę fermentacyjno probówkową oznaczenia bakterii grupy coli typu kałowego (fekalnego) stosuje się do badania każdego rodzaju wody i ścieków w przypadku, gdy zachodzi potrzeba stwierdzenia świeżego kałowego (ściekowego) zanieczyszczenia. Metoda ma szczególne zastosowanie do badań wód mętnych o małej liczbie poszukiwanych bakterii oraz chlorowanych ścieków.

Bakterie grupy coli typu kałowego (fekalnego) są to bakterie z grupy coli, które poza wszystkimi właściwościami tej grupy (pałeczki Gram-ujemne, oksydazoujemne, nie wytwarzające przetrwalników, względnie beztlenowe, fermentujące laktozę w zasadzie z wytworzeniem kwasu i gazu w temp.37oC w ciągu 48 h oraz dające charakterystyczne kolonie na pożywce Endo), mają ponadto zdolność wzrostu oraz przeprowadzania niektórych procesów biochemicznych, a wszczególności fermentowania laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu również w temperaturze 44oC.

Większość tych bakterii w wodach i ściekach to Escherichia coli (E. coli) występująca praktycznie zawsze w kale ludzkim przekraczając znacznie liczbę innych bakterii grupy coli. Dzięki temu E.coli uważana jest za typowo kałowy gatunek baketrii grupy coli.

E. coli poza właściwościami bakterii grupy coli typu kałowego ma ponadto zdolność do: wytwarzania indolu w wodzie peptonowej z tryptofanem (I), daje pozytywną reakcję z czerwienią metylową na podłożu wg Clarka (M.), nie wytwarza acetylometylokarbinolu z glukozy na podłożu wg Clarka (V) oraz nie ma zdolności wzrostu na podłożu wg Simmonsa, zawierającym cytrynian sodowy jako jedyne organiczne źródło węgla (C). Wymienione cztery cechy określa się testami biochemicznymi, znanymi jako tzw. szereg IMVC, służącymi do identyfikacji E.coli.

Zasada metody:

Wykrywanie bakterii grupy coli typu kałowego metodą fermentacyjno-probówkową (FP) oparte jest na zdolności tych bakterii fermentowania laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu w temp. 44oC. Metoda ta obejmuje badanie wstępne, w którym na podstawie wytworzonego w pożywce namnażającej kwasu i gazu w temp. 37oC w ciągu 24-48 h wnioskuje się o obecności bakterii grupy coli oraz badanie potwierdzające, które ma na celu stwierdzenie, czy bakterie fermentujące laktozę w badaniu wstępnym należą do grupy coli typu kałowego.

W przypadku konieczności zidentyfikowania tych bakterii jako E.coli, należy wykonać dodatkowo badania wg szeregu IMViC lub zastosować szybki test w temp. 44oC.

Etap I – Badania wstępne - Badania przeprowadza się, jak w przypadku bakterii grupy coli

Etap II – Badania potwierdzająceBadaniu potwierdzającemu poddaje się materiał pochodzący ze wszystkich dodatnich i wątpliwych hodowli z badania wstępnego, przy oznaczaniu bakterii z grupy coli metodą FP. W tym celu należy:

  • zawiesinę bakterii z hodowli na podłożu LPB przenieść ezą na podłoże laktozowe z zielenią brylantową i inkubować w temp. 44oC w ciągu 18-24 h;

  • za wynik dodatni przyjmuje się zmętnienie podłoża oraz obecność gazu w rurkach Durhama lub w całej objętości podłoża przy lekkim wstrząśnięciu. Równolegle z badaniami potwierdzającymi na pożywce z zielenią brylantową w temp. 44oC, wskazane jest przeprowadzenie badania potwierdzającego na podłożu Endo, jak podano w metodyce oznaczania bakterii grupy coli metodą FP.

Etap III – Badania identyfikujące Escherichia coli. Identyfikację Escherichia coli przeprowadzać można dwiema metodami: metodą szeregu IMViC oraz tzw. testu szybkiego.

Metoda szeregu IMViC. Materiał z próbek dodatnich uzyskanych po hodowli bakterii na podłożu z laktozą i z zielenią brylantową przenieść na podłoże Endo. Wyrosłe na podłożu Endo pojedyncze typowe kolonie poddaje się identyfiakcji wg szeregu IMViC, w którym oznacza się zdolność do:

  • wytwarzania indolu z tryptofanu na podłożu z wodą peptonową z tryptofanem (I);

  • rozkładu glukozy do kwasu (reakcja z czerwienią metylową) na podłożu wg Clarka (M);

  • wytwarzania acetylometylokarbinolu z glukozy (reakcja Voges-Proskauera) na podłożu wg Clarka (VP);

  • wykorzystywania cytrynianu jako jedynego źródła węgla na podłożu Simmonsa (C);


Wytwarzanie indolu – sprawdza się po 24 h inkubacji, dodając do hodowli, po ściance probówki, kilka kropli odczynnika Ehrlicha lub odczynnika Kovacsa. Pojawienie się po chwili czerwonego zabarwienia na granicy płynów świadczy o obecności indolu, co określa się jako wynik dodatni (+);

Reakcja z czerwienią metylową – wykonuje się dodając do 3-4-dniowej hodowli na podłożu Clarka, 2 krople czerwieni metylowej. Wystąpienie wyraźnie czerwonej barwy wskazuje na zakwaszenie pożywki i świadczy o dodatnim wyniku tej reakcji (+). Kolor żółty określa się jako wynik ujemny (-), kolor pomarańczowy lub bardzo jasnoczerwony – jako wynik wątpliwy (?);

Reakcja Voges-Proskauera stwierdzająca obecność acetylometylokarbinolu (V) – wykonuje się po 24 h hodowania, dodając do hodowli 0,6 cm3 r-ru α-naftolu i po dokładnym wymieszaniu 0,4 cm3 r-ru wodorotlenku potasowego. Zawartość probówki miesza się ponownie i wstawia do termostatu o temp. 37oC na 30-45 min. Wystąpienie po tym czasie intensywnego różowego lub czerwonego zabarwienia w górnej części płynu oznacza wynik dodatni (+), tzn. że w pożywce obecny jest acetylometylokarbinol. W przypadku wyniku ujemnego (-), pożywka nie zmienia barwy lub daje lekko różowe zabarwienie;

Zdolność wykorzystania cytrynianu jako jedynego źródła węgla (C ) na podłożu Simmonsa przy hodowli w temp. 44oC w ciągu 72 h, brak zabarwienia określa się jako wynik ujemny (-), charakterystyczny dla E. coli. Wzrost innych pałeczek z grupy coli powoduje alkalizacje podłoża i zmianę jej zabarwienia z zielonej na niebieską, co określa się jako wynik dodatni (+).

Typowe szczepy E.coli charakteryzują się następującymi wynikami szeregu IMViC: ++--;

wyjątkjowo zdarzają się indoloujemne szczepy E.coli i wtedy wynik szeregu IMViC przedstawia się następująco: -+--. Według szeregu IMViC identyfikuje się w sposób pewny tylko te bakterie z grupy coli, które fermentują laktozę z wytworzeniem kwasu i gazu w 44oC.

Metoda tzw. testu szybkiego

  • materiał z każdej dodatniej i wątpliwej hodowli na podłożu LPB posiać na podłoże z zielenią brylantową i na wodę peptonową z tryptofanem;

  • próbki inkubować w temp. 44oC przez 24 h. Wyniki dodatnie obu reakcji, z dużym prawdopodobieństwem, świadczą o obecności E.coli, ponieważ są one w zasadzie jedynymi bakteriami z rodziny Enterobacteriaceae, które fermentują laktozę z wytworzeniem gazu i wytwarzają indol w temp. 44oC.

Wynik oznaczenia bakterii z grupy coli podać jako NPL w 100 cm3 i miano bakterii grupy coli i bakterii coli typu kałowego (Escherichia coli). Wyniki należy podawać w natępujący sposób:

NPL bakterii gupy coli w 100 cm3.

Ćwiczenie 7. Oznaczanie beztlenowych bakterii przetrwalnikujących redukujących siarczyny

(Clostridium) metodą hodowli na pożywce płynnej

Metodę stosuje się do wykrywania bakterii beztlenowych przetrwalnikujących, redukujących siarczyny (Clostridium) w wodzie i ściekach. Bakterie przetrwalnikujące, redukujące siarczyny należą do rodziny Bacillaceae, rodzaju Clostridium. Rozwijają się w warunkach beztlenowych i są Gram-dodatnie. Na ogół bakterie z tej grupy powszechnie występują w glebie, wodzie, ściekach, kale ludzkim i niektórych zwierząt. Dzięki zdolności wytwarzania przetrwalników są oporne na działanie chloru i innych związków dezynfekcyjnych.

Metoda polega na posianiu odpowiedniej objętości próbki wody lub ścieków na pożywkę płynną (np. 1x 50 cm3 i 5x10 cm3). W wyniku wytrącającego się siarczku żelaza pod wpływem rozwijających się bakterii pożywka barwi się na kolor od szarego do smolistoczarnego.

Wykonanie:

1. Przed przystąpieniem do oznaczenia należy zniszczyć obecne w probówce formy wegetatywne bakterii. W tym celu należy próbki z pożywką należy ogrzać do temperatury 80oC w łaźni wodnej i przetrzymać w tej temperaturze ok.20 min., licząc czas od osiągnięcia tej temperatury w próbce.

2. Po tym czasie próbkę należy ochłodzić i dodać w sposób jałowy odpowiednią ilość cyrynianu żelazowego i roztworu siarczynu sodu. W celu odcięcia dostępu powietrza do pożywki dodać odpowiednią objętość jałowej płynnej parafiny, aby tworzyła nad pożywką ok. 1,5 – centymetrową warstwę;

3. Posiane próbki inkubować w cieplarce, w temperaturze 37oC przez 24-48 h;

Beztlenowe bakterie przetrwalnikujące, redukujące siarczyny, rozwijające się pożywce zmieniają jej barwę od szarej do czarnej. Wszystkie próbki o zmienionej barwie pożywki od szarej do czarnej należy uznać za dodatnie.

Wyniki należy podać w postaci NPL beztlenowych przetrwalnikujących bakterii redukujących siarczyny (Clostridium).


1 Dopuszcza się pojedyncze bakterie wykrywane sporadycznie

2 Należy badać w wodzie pochodzącej z ujęć powierzchniowych i mieszanych, a w przypadku przekroczenia dopuszczalnych wartości, należy zbadać czy nie ma zagrożenia zdrowia ludzkiego wynikającego z obecności innych mikroorganizmów chorobotwórczych, np. Cryptosporidium.

3 Należy badać w ciepłej wodzie w budynkach zamieszkania zbiorowego i zakładach opieki zdrowotnej zamkniętej

mikro 008.jpg

Plik dostępny po zalogowaniu.

mikro 016.jpg

Plik dostępny po zalogowaniu.

mikro 004.jpg

Plik dostępny po zalogowaniu.

MIKROBIOLOGIA laboratorium 2 Morfologia komorki bakteryjnej. Barwienie zlozone.doc

Podgląd pliku (pełna wersja wyższej jakości po zalogowaniu):

Temat 2: Morfologia komórki bakteryjnej. Barwienie złożone



Literatura:


  1. Kocwowa E.: Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej dla wyższych szkół technicznych. PWN 1984, str. 32-49, 78-84, 95-101,

  2. Grabińska – Łoniewska A.: Ćwiczenia laboratoryjne z mikrobiologii ogólnej. Politechnika Warszawska 1996, str. 13-19.


Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien:

rozumieć procedurę barwienia Grama i umieć wykonać preparat barwiony tą metodą; znać różnice między bakteriami gramdodatnimi i gramujemnymi; wiedzieć, które formy morfologiczne komórek barwią się dodatnio, a które ujemnie metodą Grama; znać pojęcia: forma wegetatywna i forma przetrwalna bakterii; wiedzieć, co to są endospory i umieć wykonać preparat barwiony metodą Wirtza.


Najczęściej stosowaną w mikrobiologii techniką barwienia jest metoda Grama (od nazwiska duńskiego badacza). Jest to barwienie złożone pozytywne, w którym stosuje się kolejno dwa kontrastowe barwniki zasadowe: fioletowy (fiolet krystaliczny) i czerwony (fuksyna). Właściwy proces barwienia poprzedzony jest termicznym utrwaleniem preparatu. Barwienie to składa się z następujących etapów:

  • zabarwienia preparatu fioletem krystalicznym,

  • utrwalenia zabarwienia przez dodanie jodu w postaci płynu Lugola (roztwór J2 w KJ),

  • wymycia barwnika alkoholem,

  • dobarwienia preparatu barwnikiem kontrastowym – fuksyną.

Po dodaniu pierwszego barwnika wszystkie komórki barwią się na fioletowo. Dodanie płynu Lugola powoduje powstanie nierozpuszczalnego kompleksu fioletu krystalicznego z jodem. Kompleks ten jest następnie ekstrahowany 95 % alkoholem. Okazuje się, że te bakterie, które mają grubą warstwę mureiny (peptydoglikanu) w ścianie komórkowej nie tracą barwnego kompleksu i pozostają fioletowe po działaniu alkoholem. Te natomiast, których warstwa mureiny jest cienka, łatwo tracą barwnik i ulegają odbarwieniu. Aby je uwidocznić stosuje się drugi barwnik – kontrastowy, którym jest czerwona fuksyna zasadowa. W efekcie część komórek zabarwi się na fioletowo, a część na czerwono. Te pierwsze określa się mianem bakterii gramdodatnich, drugie mianem bakterii gramujemnych.

Barwienie Grama jest więc barwieniem różnicowym, gdyż pozwala zróżnicować bakterie na dwie podstawowe grupy, w zależności od tego, którym barwnikiem się zabarwią. Strukturalnym podłożem tych różnic jest przede wszystkim różnica w budowie ściany komórkowej.

Znaczenie barwienia Grama polega na tym, że różnice w barwliwości bakterii gramdodatnich i gramujemnych są skorelowane z innymi, bardziej istotnymi różnicami między nimi. Oto tylko niektóre z nich:


Bakterie gramdodatnie:

  • mają grubą ścianę komórkową z dużym procentowym udziałem mureiny,

  • są wrażliwe na penicylinę,

  • są wrażliwe na lizozym (enzym występujący np. we łzach), który rozpuszcza ich ścianę komórkową (a konkretnie peptydoglikan mureinę) pozostawiając tzw. protoplasty – komórki bez ściany,

  • są bardzo wrażliwe na detergenty anionowe,

  • część z nich ma zdolność wytwarzania przetrwalników (endospor).


Bakterie gramujemne:

  • mają cienką ścianę komórkową z niewielkim udziałem peptydoglikanu ale z dodatkową specyficzną błoną na zewnątrz ściany (tzw. błoną zewnętrzną),

  • są zwykle mało wrażliwe na penicylinę,

  • są odporne na działanie samego lizozymu,

  • są mało wrażliwe na detergenty anionowe,

  • nie mają zdolności do wytwarzania endospor.


Bakteriami gramdodatnimi są zasadniczo laseczki i ziarniaki, natomiast typowe pałeczki

(np. pałeczki jelitowe) są gramujemne. Barwliwość metodą Grama nie jest cechą stałą bakterii. Niektóre z nich, w zasadzie gramdodatnie, w starych hodowlach barwią się gramujemnie lub mozaikowato: część komórki jest fioletowa a część czerwona. Dlatego wiarygodny wynik barwienia dają tylko komórki pochodzące ze świeżych hodowli. Trzeba też wspomnieć, że nie wszystkie bakterie barwią się metodą Grama, np. prątki, zaliczane do promieniowców (w tym słynny prątek gruźlicy) mają ścianę tak silnie wysyconą substancjami lipidowymi i woskami, że barwniki nie wnikają do wnętrza ich komórek. Natomiast barwią się metodą Grama grzyby (np. drożdże), które zwykle są gramdodatnie.


Niektóre bakterie mogą występować zarówno w postaci komórek wegetatywnych, tzn. aktywnych metabolicznie i zdolnych do rozmnażania się, odżywiania, poruszania itd., jak i w postaci form przetrwalnych, których aktywność życiowa jest zahamowana. Najbardziej znaną formą przetrwaną są endospory, zwane też przetrwalnikami. Wytwarzają je głównie laseczki tlenowe z rodzaju Bacillus i laseczki beztlenowe z rodzaju Clostridium. Tworzą one endospory w niekorzystnych warunkach, szczególnie po wyczerpaniu się w podłożu substancji pokarmowych. Endospory są niezwykle odporne na wysoką temperaturę, wysychanie, promieniowanie, a także na działanie związków chemicznych, w tym barwników. W korzystnych warunkach są one zdolne przejść z powrotem w formę wegetatywną. W celu zabarwienia przetrwalników stosuje się specjalne metody z zastosowaniem wysokiej temperatury umożliwiającej przeniknięcie barwnika przez osłony endospor.













CZĘŚĆ PRAKTYCZNA



Zadanie 1. Wykonanie barwienia metodą Grama


Przygotowanie preparatu i utrwalenie go:


  1. Odtłuścić na sucho szkiełko przedmiotowe pocierając je dość mocno kawałkiem mydła (z jednej strony), po czym usunąć jego resztki czystą szmatką.

  2. Zapalić palnik gazowy i wyżarzyć w płomieniu ezę.

  3. Po ostudzeniu ezy opalić korek i wylot probówki zawierającej zawiesinę bakterii przeznaczoną do barwienia.

  4. Małym palcem tej ręki, która trzyma ezę wyciągnąć korek z probówki i (trzymając go) pobrać ezą hodowlę bakterii.

  5. Opalić wylot probówki i korek, a następnie zamknąć nim probówkę.

  6. Odstawić probówkę do statywu.

  7. Wykonać rozmaz pobranej zawiesiny po odtłuszczonej powierzchni szkiełka.

  8. Odłożyć preparat na ramki wanienki w celu wysuszenia.

  9. Wyżarzyć ezę i odstawić ją do statywu.

  10. Po wyschnięciu preparatu chwycić go pęsetą i trzykrotnie przesunąć nad płomieniem palnika (utrwalanie termiczne).


Barwienie metodą Grama:

.

  1. Odczekać chwilę i zalać utrwalony preparat fioletem krystalicznym na 1,5 minuty.

  2. Spłukać niewielką ilością wody i zalać płynem Lugola na 1,5 minuty.

  3. Spłukać wodą i polewać alkoholem (denaturatem) do 30 sekund (nie dłużej !).

  4. Spłukać dokładnie wodą.

  5. Zalać fuksyną na 20 - 30 sekund (nie dłużej !).

  6. Spłukać dokładnie wodą i wysuszyć przykładając delikatnie kawałki bibuły.

  7. Umieścić preparat na stoliku mikroskopowym i położyć kroplę olejku imersyjnego na środek preparatu.

  8. Nastawić obiektyw imersyjny (100x) i kręcąc śrubą makrometryczną obniżać go aż do momentu zetknięcia się czoła obiektywu z olejkiem.

  9. Śrubą mikrometryczną nastawić ostrość i obserwować preparat.


Określ morfologię obserwowanych komórek i wykonaj kolorowy rysunek.

Które typy morfologiczne bakterii barwią się metodą Grama dodatnio, a które ujemnie?













Zadanie 2. Wykonanie barwienia przetrwalników metodą Wirtza

1. Wykonać preparat utrwalony z zawiesiny laseczek Bacillus sp. jak w zadaniu 1

2. Zalać preparat wodnym roztworem zieleni malachitowej

3. Uchwycić preparat za pomocą szczypiec i podgrzewać nad płomieniem palnika do

pojawienia się pary, po czym odsunąć preparat znad płomienia i odczekać aż

przestanie parować

4. Czynność powtarzać przez 5 minut uzupełniając odparowujący barwnik

5. Odczekać, aż preparat ostygnie

6. Spłukać dokładnie wodą destylowaną

5. Dobarwić roztworem fuksyny fenolowej przez 1 minutę

6. Spłukać wodą i wysuszyć

7. Obserwować pod imersją jak w zadaniu 1.


Wykonaj kolorowy rysunek:







MIKROBIOLOGIA_laboratorium_12-13_Mikrobiologia_osadu_czynnego.doc

Podgląd pliku (pełna wersja wyższej jakości po zalogowaniu):

Temat 12-13: Mikrobiologia osadu czynnego



Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien:

znać podział metod oczyszczania ścieków; wiedzieć, co to jest osad czynny i flokulacja; umieć scharakteryzować morfologię kłaczka (wielkość, kształt, struktura, nitkowatość); umieć opisać sukcesję mikroorganizmów w osadzie czynnym; znać rolę poszczególnych grup drobnoustrojów w oczyszczaniu ścieków i ich znaczenie wskaźnikowe w ocenie pracy osadu; wiedzieć co to jest i od czego zależy puchnięcie włókniste i niewłókniste osadu; znać pojęcie indeksu osadu czynnego.




Wyróżnia się trzy zasadnicze metody oczyszczania ścieków : mechaniczne, chemiczne i biologiczne. W konkretnej oczyszczalni mogą być wykorzystane wszystkie wymienione sposoby lub niektóre z nich. W oczyszczalniach biologicznych zanim ścieki zostaną poddane działaniu mikroorganizmów, są wstępnie oczyszczane na drodze mechanicznej np. na kratach, w osadnikach czy piaskownikach. Istnieją cztery stopnie oczyszczania ścieków :

I stopień - oczyszczanie mechaniczne, polegające na usuwaniu zanieczyszczeń stałych, do zawiesin opadających włącznie,

II stopień - oczyszczanie biologiczne usuwające zanieczyszczenia rozpuszczone,

III stopień - usuwanie związków biogennych (głównie soli azotu i fosforu),

IV stopień - usuwanie resztkowych zanieczyszczeń trudno rozkładalnych, tzw. związków refrakcyjnych (ten stopień oczyszczania określany jest jako odnowa wody).

Biologiczne oczyszczanie ścieków opiera się na naturalnych procesach samooczyszczania, które zachodzą w każdym zbiorniku wodnym oraz w glebie, głównie dzięki aktywności drobnoustrojów. Jednak zdolności samooczyszczania są często niewystarczające do unieszkodliwienia tak dużych ilości ścieków, jakie powstają w wyniku działalności człowieka. Dlatego w biologicznym oczyszczaniu dużych ładunków zanieczyszczeń intensywność procesów samooczyszczania musi być zwielokrotniona metodami inżynieryjnymi. Metody oczyszczania wykorzystujące specjalne urządzenia intensyfikujące te naturalne procesy określa się jako sztuczne, natomiast metody oparte wyłącznie na procesach samooczyszczania nazywane są metodami naturalnymi. Część naturalnych sposobów oczyszczania ścieków ma charakter pośredni ze względu na pewien stopień ingerencji człowieka w proces.

Do naturalnych metod oczyszczania należą m. in.: nawadnianie szerokoprzestrzenne pól, filtry gruntowe, stawy ściekowe i oczyszczalnie hydrobotaniczne (np. trzcinowe).

Do sztucznych biologicznych metod oczyszczania należą: złoża biologiczne i osad czynny. Sztuczne metody biologicznego oczyszczania ścieków, podobnie jak naturalne, wykorzystują procesy samooczyszczania zachodzące w naturze, jednak ze zwielokrotnioną intensywnością. Np. procesy przebiegające w złożach biologicznych przypominają samooczyszczanie w glebie (udoskonalone „filtry gruntowe”), a metoda osadu czynnego opiera się na podobnych zjawiskach zachodzących w środowisku wodnym (ulepszone „stawy ściekowe”).

Osad czynny jest metodą oczyszczania, w której elementem oczyszczającym są bakterie zlepione w kłaczki zawieszone w środowisku płynnym (ścieki). Kłaczki osadu powstają podobnie jak błona biologiczna, w wyniku łączenia się bakterii zooglealnych wytwarzających lepki śluz. Proces tworzenia się kłaczków, zwany flokulacją, zachodzi spontanicznie w trakcie napowietrzania komory wypełnionej ściekami.

W oczyszczalniach pracujących metodą osadu czynnego ścieki, po oczyszczaniu mechanicznym w osadniku wstępnym, są kierowane do komory osadu czynnego, zwanej też komorą napowietrzania, gdzie odbywa się właściwe oczyszczanie biologiczne. Kłaczki osadu wchodzą tu w kontakt ze ściekami w warunkach sztucznego napowietrzania i intensywnego mieszania. Bakterie obecne w kłaczkach pochłaniają substancję organiczną ze ścieków i część jej zużywają jako paliwo (źródło energii), część natomiast przyswajają jako materię budulcową, co prowadzi do zwiększenia biomasy. Efektem tych procesów jest mineralizacja ścieków i wzrost masy osadu czynnego.


Wykorzystanie zanieczyszczeń przez bakterie osadu czynnego.


Po kilku godzinach przetrzymywania ścieków w komorze, są one przepuszczane do osadnika wtórnego, w którym zachodzi oddzielenie kłaczków od oczyszczonych ścieków. Kłaczki osadzają się na dnie osadnika i są recyrkulowane albo z powrotem do komory napowietrzania, by utrzymać stężenie biomasy (osad powrotny), albo do osadnika wstępnego i wraz z osadem wstępnym usuwane z obiegu oraz unieszkodliwiane (osad nadmierny). Układ technologiczny procesu osadu czynnego przedstawia rysunek:

Układ oczyszczalni ścieków z osadem czynnym:

1 - osadnik wstępny, 2 - komora osadu czynnego, 3 - osadnik wtórny, 4 - stacja pomp osadowych, Qść - ścieki, Qn - osad nadmierny, Qr - osad powrotny


Jako, że elementem oczyszczającym w tej metodzie są kłaczki zlepionych bakterii, dlatego ważne jest, aby proces flokulacji przebiegał prawidłowo i aby powstałe kłaczki miały odpowiednią wielkość, kształt i strukturę. Flokulacja zależy od stopnia obciążenia osadu ładunkiem zanieczyszczeń. Przy bardzo wysokim i bardzo niskim obciążeniu obserwuje się bowiem zjawisko deflokulacji, czyli rozpraszania się bakterii skupionych w kłaczki. Gdy osad jest nadmiernie obciążony, kłaczki są nie dotlenione, natomiast w przypadku niedociążenia bakterie giną z braku pokarmu.

Wielkość kłaczków jest istotną cechą wpływającą na efektywność oczyszczania. Zależą od niej dwa ważne procesy: biosorpcja (pochłanianie zanieczyszczeń ) i sedymentacja (opadanie kłaczków). Biosorpcja jest etapem poprzedzającym biodegradację i zależy od wielkości powierzchni kłaczków. Powierzchnia ta jest tym większa, im kłaczki są mniejsze. Jednak zbyt małe kłaczki, choć mają dużą powierzchnię sorpcyjną, źle opadają w osadniku wtórnym. Może to prowadzić do wtórnego zanieczyszczenia odbiornika, do którego odprowadza się oczyszczone, ale nie oddzielone od kłaczków ścieki. Natomiast kłaczki zbyt duże, choć świetnie sedymentują, to jednocześnie słabo oczyszczają ścieki. Wynika to z faktu, że bakterie umieszczone w centralnej części dużego kłaczka mają utrudniony dostęp do tlenu i zanieczyszczeń będących substratem pokarmowym. Kłaczki muszą więc wykazywać właściwy stan rozdrobnienia zapewniający odpowiednie warunki tlenowe i pokarmowe.

Kształt kłaczków jest cechą, która może wskazywać na pewne niekorzystne zjawiska w osadzie. Np. kształt gwiaździsty, pierzasty czy siatkowaty wiążą się zwykle z obecnością mikroorganizmów nitkowatych (głównie bakterii i grzybów), których obecność w osadzie jest niepożądana, gdyż powodują jego puchnięcie.

Struktura kłaczka może być spoista bądź luźna. W warunkach niedotlenienia lub braku pokarmu kłaczki przybierają formę zbitych, obłonionych tworów koloru szarego. Obecność takich kłaczków w osadzie powoduje spadek jego aktywności. Wiele różnych czynników powoduje rozluźnienie kłaczków. Należą do nich: rozwój form nitkowatych, nadmiar lub niedostatek tlenu, przeciążenie osadu lub warunki głodowe.

Niekorzystnym zjawiskiem obniżającym zdolności sedymentacyjne kłaczków jest puchnięcie osadu czynnego. Z puchnięciem mamy do czynienia, gdy zwiększa się objętość osadu przy zachowaniu tej samej masy. Liczbowo wyraża to indeks osadu, który przedstawia objętość (w cm3) jednego grama jego suchej masy. Indeks wyraża więc gęstość osadu, lub stopień uwodnienia. Jeden gram suchej masy dobrze pracującego osadu czynnego ma zwykle objętość 67 cm3 (indeks = 67 cm3/g). Indeks osadu spuchniętego mieści się w granicach od 100 - 400 cm3/g. Spuchnięty osad jest co prawda bardzo aktywny (duża powierzchnia biosorpcyjna), jednak z powodu obniżonej opadalności nie może być on oddzielony od oczyszczonych ścieków w osadniku wtórnym . Wiele jest przyczyn puchnięcia osadu. Bezpośrednią przyczyną tego zjawiska mogą być organizmy nitkowate, bakterie zooglealne, rozproszenie kłaczków lub wzrost lekkości osadu spowodowany wydzielaniem się pęcherzyków gazu. Organizmy nitkowate (głównie bakterie i grzyby) wywołują tzw. puchnięcie włókniste. Zwykle dochodzi do niego, gdy skład ścieków jest niewłaściwy (zbyt duże ilości węglowodanów w stosunku do azotu i fosforu), w sytuacji przeciążenia osadu, nagłych zmian obciążenia , niedotlenienia, zakwaszenia, zatrucia, obniżenia temperatury lub niedostatecznie długiego przetrzymywania osadu w komorze napowietrzania. Do najczęściej spotykanych mikroorganizmów nitkowatych należą bakterie: Sphaerotilus, Beggiatoa i promieniowce. Mniej poznanym zjawiskiem jest puchnięcie niewłókniste. Wywołane jest ono nadmierną produkcją pozakomórkowych substancji śluzowych przez pewne bakterie zooglealne. Śluzy te wiążą bardzo dużo wody, co sprawia, że osad jest czterokrotnie silniej uwodniony niż w przypadku spuchnięcia włóknistego. Zwiększenie indeksu osadu może też spowodować rozproszenie kłaczków w wyniku zbyt silnej turbulencji w komorze lub też wynoszenie osadu w osadniku wtórnym. Z tym drugim przypadkiem mamy do czynienia, gdy osad jest zbyt długo przetrzymywany w osadniku i dochodzi do rozwoju beztlenowych bakterii denitryfikacyjnych wydzielających pęcherzyki azotu cząsteczkowego.

Bakterie tworzące kłaczki nie są jedynymi organizmami występującymi w osadzie czynnym. Oprócz bakterii występują tu liczne pierwotniaki i wrotki, rzadziej robaki, pierścienice i grzyby. Biocenoza osadu czynnego ma charakter heterotroficzny.


Piramida przedstawiająca zależności troficzne w osadzie czynnym.


Bazą pokarmową całego zespołu organizmów jest materia organiczna dopływająca wraz ze ściekami. Pierwszy poziom troficzny tworzą bakterie heterotroficzne, grzyby i pierwotniaki saprotroficzne (korzenionóżki i wiciowce), które odżywiają się materią organiczną w postaci roztworów i zawiesin. Drugi poziom stanowią pierwotniaki holozoiczne (gr.holos - cały) odżywiające się całymi mikroorganizmami. Należą tu orzęski. Wreszcie, najwyższy poziom troficzny zajmują orzęski drapieżne (zwłaszcza osiadłe gatunki z grupy Suctoria, które zjadają pierwotniaki bakteriożerne) , a także bezkręgowce takie, jak wrotki, robaki z grupy nicieni i in.

Organizmy obecne we wpracowanym osadzie czynnym tworzą zespół, który powstał w wyniku procesu sukcesji. Początkowo w ściekach obecne są głównie bakterie, wiciowce (Zooflagellata) i korzenionóżki (ameby) (Rhizopoda), a więc organizmy odżywiające się materią organiczną zawartą w ściekach. Z czasem pojawiają się orzęski (Ciliata) zjadające bakterie i drapieżne. Z orzęsków najwcześniej rozwijają się formy wolno pływające, pożerające bakterie, które nie zlepiły się jeszcze w kłaczki (nie sflokulowane). W następnym etapie, gdy proces flokulacji jest już zaawansowany, pojawiają się formy osiadłe orzęsków (przyczepione do kłaczków). W ostatnim etapie rozwijają się wrotki (Rotatoria). Opisane przemiany ilustruje wykres:





Sukcesja mikroorganizmów podczas hodowli osadu czynnego


Znajomość przemian sukcesyjnych w osadzie oraz właściwości biologicznych mikroorganizmów jest przydatna w ocenie pracy oczyszczalni. Służy do tego analiza mikroskopowa próbki osadu, obejmująca, oprócz opisu wyglądu kłaczków, również badanie składu mikrofauny. Stwierdzenie dużej liczebności wiciowców i ameb (korzenionóżek), a więc pierwotniaków pionierskich, świadczy o przeciążeniu osadu i jego niedotlenieniu (a więc o warunkach przypominających początkowe etapy rozwoju osadu). Występowanie orzęsków natomiast, zwykle świadczy o dobrej pracy osadu. Dotyczy to zwłaszcza form osiadłych. Orzęski bakteriożerne wywierają stałą presję na populacje bakteryjne, które pobudzane są przez to do ciągłych podziałów. Wynikiem tego jest odmładzanie się flory bakteryjnej i jej zwiększona aktywność metaboliczna. Poza tym orzęski przyczyniają się do klarowania ścieków zjadając nie sflokulowane bakterie. Obecność w osadzie wrotków zwykle świadczy o dobrym natlenieniu osadu i jego stabilizacji.




CZĘŚĆ PRAKTYCZNA



Zadanie 1. Oznaczenie objętości osadu czynnego


  1. Do leja Imhoffa wlać 1 dm3 zawartości komory osadu czynnego

  2. Pozostawić osad na 30 min. w celu sedymentacji

  3. Określić objętość osadu czynnego. Wyniki podać w [cm3/dm3].


Zadanie 2. Oznaczanie suchej masy osadu czynnego


  1. Pobrać 10 cm3 zawartości komory osadu czynnego i filtrować przez zważone i wysuszone w 1050C sączki bibułowe.

  2. Po przefiltrowaniu suszyć sączki z osadem do stałej wagi w temp. 1050C.

  3. Zważyć sączek z osadem i obliczyć wagę wysuszonego osadu (suchą masę). Wynik podać w [g s.m./dm3].


Zadanie 3. Wyznaczanie indeksu osadu czynnego


Indeks obliczyć korzystając ze wzoru: I =



Zadanie 4. Badanie aktywności enzymatycznej osadu czynnego

a. Aktywność dehydrogenazowa (test TTC)

Dehydrogenazy to enzymy katalizujące odłączanie wodoru od utlenianego substratu. Aktywność dehydrogenazową określa się za pomocą sztucznego akceptora wodoru, który przejmuje go od dehydrogenazy i na skutek redukcji zmienia swoje zabarwienie. Tym akceptorem jest chlorek trifenylotetrazolowy – TTC. Bezbarwny TTC ulega redukcji do czerwonego formazanu (trifenylofurazonu – TF).

1. Do probówki wlać pipetą 1 cm3 buforu Tris o pH 8,4 i 1 cm3 osadu czynnego

2. Dodać 0,4 cm3 roztworu TTC i umieścić probówkę w termostacie o temp. 37C

3. Inkubować przez 30 min.

Pojawienie się czerwonego zabarwienia świadczy o aktywności dehydrogenazowej osadu


b. Aktywność oksydazowa

W omawianym ćwiczeniu będzie wykrywana pewna specyficzna grupa oksydaz - oksydazy fenolowe. Przenoszą one elektrony i protony ze związków fenolowych na tlen. Związki fenolowe (np.pirokatechina) w wyniku utlenienia przechodzą w chinony, które ulegają spontanicznej polimeryzacji z wytworzeniem ciemno zabarwionych barwników melaninowych.


1. Wlać do probówki 1 cm3 osadu czynnego

2. Dodać kilka kropli 1% roztworu pirokatechiny

3. Inkubować w temp. 40C przez 15 min

Pojawienie się brunatnej barwy świadczy o aktywności oksydazowej próby.


c. Aktywność katalazowa

Katalaza, podobnie jak dehydrogenaza i oksydaza, należy do oksydoreduktaz. Jest to enzym powszechnie występujący w komórkach organizmów tlenowych i jest jednym z najszybciej działających enzymów (rozkłada truciznę – H2O2.). Mechanizm działania katalazy polega na oderwaniu tlenu od jednej cząsteczki H2O2 i przeniesieniu go na drugą cząsteczkę H2O2. W efekcie dochodzi do rozpadu obu cząsteczek nadtlenku wodoru i wytworzenia dwu cząsteczek H2O oraz wydzielenia tlenu. Reakcja przebiega następująco:

H2O2 + H2O2 KATALAZA 2 H2O + O2


1. Do probówki wprowadzić 1 cm3 osadu czynnego

2. Dodać kilka kropli roztworu H2O2 i obserwować pojawiające się zmiany.

Pojawienie się pęcherzyków gazu (jakiego?) świadczy o aktywności katalazowej.


d. Aktywność proteazowa

Proteaza jest hydrolazą katalizującą hydrolizę białek. Żelatyna jest białkiem, które pod wpływem proteazy ulega hydrolizie, co przejawia się jej upłynnieniem.


1. Posiać osad metodą kłutą na słupek żelatynowy.

2. Po tygodniu inkubacji w temp. pokojowej sprawdzić, czy żelatyna uległa upłynnieniu.


e. Aktywność ureazowa

Ureaza jest hydrolazą katalizującą rozkład mocznika CO(NH2)2. W wyniku reakcji uwalniają się grupy aminowe (-NH2)), które w roztworze wodnym przyjmują postać kationów amonowych (NH4+) alkalizujących środowisko. Zmiana odczynu na zasadowy, wykrywana zmianą zabarwienia indykatora obecnego w pożywce, pośrednio świadczy o aktywności ureazowej.

1. Wprowadzić ezą próbkę osadu czynnego do pożywki

2. Inkubować w temp. 37C przez 48 godz.

W przypadku aktywności ureazowej pożywka zmieni kolor na amarantowy.


Zadanie 5. Makroskopowa i mikroskopowa analiza osadu czynnego


1. Próbę osadu czynnego ocenić pod względem następujących cech:

- barwa osadu,

- zapach osadu,

- obecność piany,

- wygląd cieczy nadosadowej

2. Wykonać preparat przyżyciowy osadu czynnego

3. Obserwować osad pod mikroskopem zwracając uwagę na morfologię kłaczków i skład

jakościowy mikrobiocenozy osadu czynnego

4. Wyniki obserwacji wpisać do arkusza


MIKROBIOLOGIA laboratorium 1 Morfologia komorki i kolonii bakteryjnej. Barwienie proste.doc

Podgląd pliku (pełna wersja wyższej jakości po zalogowaniu):

Temat 1: Morfologia komórki i kolonii. Barwienie pozytywne proste

i barwienie negatywne


Literatura:


  1. Kocwowa E.: Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej dla wyższych szkół technicznych. PWN 1984, str. 32-49 (mikroskop, imersja, preparaty), 78-84 (metody barwienia), 95-101 (morfologia komórki i kolonii),

  2. Grabińska – Łoniewska A.: Ćwiczenia laboratoryjne z mikrobiologii ogólnej. Politechnika Warszawska 1996, str. 13-19 (mikroskop, metody barwienia, pomiar wielkości komórek, preparaty).


Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien:

wiedzieć, w jakim celu określa się morfologię komórek i kolonii; znać podstawowe typy morfologiczne komórek bakteryjnych; znać rodzaje preparatów i etapy ich przygotowania; wiedzieć, dlaczego barwi się komórki drobnoustrojów; znać ogólny podział metod barwienia preparatów; rozumieć, dlaczego przy użyciu obiektywu o powiększeniu 100x stosuje się olejek imersyjny; znać cechy, które bierze się pod uwagę przy opisie morfologii kolonii i umieć opisać wybraną kolonię; znać pojęcia: morfologia, imersja, pleomorfizm, kolonia, kolonia typu S i R; umieć wykonać preparat barwiony błękitem metylenowym i preparat barwiony negatywnie.


Morfologia zajmuje się zewnętrznym wyglądem komórek i ich zgrupowań.(z gr. morphe – kształt). Ma to znaczenie w identyfikacji drobnoustrojów, czyli określeniu, z jakim gatunkiem mamy do czynienia. Oczywiście na podstawie jedynie cech morfologicznych nie da się precyzyjnie zidentyfikować gatunku (konieczne są tu również m. in. testy biochemiczne). Badania te dostarczają jednak niezbędnych wstępnych informacji pozwalających zawęzić krąg poszukiwań. Na przykład stwierdzenie, że badane komórki mają kształt kulisty, pozwala wykluczyć dużą grupę bakterii cylindrycznych.

Komórki bakteryjne mają rozmiar rzędu 1 m (10-6m). Ich kształt da się sprowadzić do trzech podstawowych typów morfologicznych:

  • kulisty,

  • cylindryczny,

  • skręcony.

Formy kuliste nazywane są ziarniakami (łac. coccus). Ziarniaki mogą występować jako

pojedyncze komórki lub układy dwukomórkowe (dwoinki), wielokomórkowe ułożone w pakiety sześcienne (pakietowce), łańcuszki (paciorkowce) lub grona (gronkowce).

Formy cylindryczne nazywa się pałeczkami (łac. bacterium). Należy tu najważniejsza z sanitarnego punktu widzenia grupa bakterii - bakterie jelitowe. Niektóre pałeczki są na jednym końcu grubsze i przypominają maczugę (corynebacterium - maczugowiec). Część form pałeczkowatych bardziej wydłużona i prostopadle ucięta na końcach określana jest mianem laseczek (łac. bacillus). Laseczki mają zdolność do wytwarzania wewnątrz komórek tzw. przetrwalników (endospor), które sprawiają, że są one niezwykle odporne na niekorzystne warunki środowiska (wytrzymują gotowanie i długotrwałe wysuszenie).

Formy skręcone mają zwykle albo postać przecinkowato zgiętych pałeczek (przecinkowce) albo komórek skręconych śrubowato (śrubowce i krętki).

Niektóre bakterie tworzą formy nitkowate, w tym rozgałęzione (np. promieniowce). Jeszcze inne wykazują tzw. pleomorfizm (wielopostaciowość) przybierając różne formy morfologiczne. Np. pospolite bakterie glebowe z rodzaju Arthrobacter w zależności od ilości składników pokarmowych w podłożu, mają albo postać pałeczek (gdy jest dużo pokarmu) albo ziarniaków (w warunkach głodowych). Dlatego formy te określa się mianem ziarniakopałeczek. Pleomorfizm można też wywołać sztucznie, np. działając penicyliną, która zaburza syntezę ściany komórkowej. Powstają wówczas komórki o zniekształconym, wydłużonym i często rozgałęzionym kształcie, tzw. formy L. Po zaprzestaniu działania czynnika szkodliwego, komórki wracają do swojej naturalnej postaci.

W stanie naturalnym bakterie są słabo widoczne pod mikroskopem i trudno jest określić ich morfologię. Dlatego w celu ich lepszego uwidocznienia stosuje się różnorodne techniki barwienia. Ogólnie barwienie dzieli się na

  • proste, gdy używa się jednego barwnika,

  • złożone, gdy używa się przynajmniej dwóch barwników.

Stosując inne kryterium podziału można wyróżnić:

  • barwienie pozytywne, gdy barwi się obiekt badań,

  • barwienie negatywne, gdy barwi się jedynie tło.

Aby zabarwić bakterie, należy najpierw wykonać preparat. Preparat wykonuje się na szkiełku mikroskopowym przedmiotowym (podstawowym) przez naniesienie drobnoustrojów na jego powierzchnię. Wyróżnia się dwa podstawowe rodzaje preparatów:

  • preparaty przyżyciowe,

  • preparaty utrwalone.

W pierwszym przypadku naniesione na szkiełko mikroorganizmy zachowuje się przy życiu, a w drugim komórki poddaje się tzw. utrwaleniu. Celem utrwalania jest zwiększenie podatności komórek na barwienie i zapobieżenie zmyciu komórek ze szkiełka w trakcie procesu barwienia. Utrwalanie może polegać np. na ogrzewaniu preparatu w płomieniu palnika lub na polaniu go alkoholem. W efekcie komórki giną i ich osłony stają się przepuszczalne dla barwników. Poza tym wewnętrzne struktury komórkowe ulegają denaturacji odsłaniając grupy funkcyjne makromolekuł reagujące z barwnikami.

Do barwienia pozytywnego stosuje się zwykle barwniki zasadowe, czyli takie, które w roztworach wodnych mają ładunek dodatni. Dodatnio naładowane jony barwnika łatwo łączą się bowiem ze zwykle ujemnie naładowanymi komórkami bakterii. Często stosowanymi barwnikami zasadowymi są m. in.: błękit metylenowy, fiolet krystaliczny, fuksyna karbolowa i safranina. Inną techniką barwienia bakterii jest barwienie negatywne, w którym barwi się nie obiekt, lecz tło. Używa się do tego celu barwników kwaśnych o ładunku ujemnym, których jony są odpychane od bakteryjnych ścian komórkowych. Są to barwniki o charakterze tuszu np. tusz chiński lub nigrozyna. Barwienie negatywne stosuje się wówczas, kiedy chcemy lepiej uwidocznić bakterie nie przyjmujące barwników (np. krętki wywołujące kiłę) lub w celu uwidocznienia otoczek bakteryjnych.

Komórka bakteryjna po dostaniu się na powierzchnię zestalonej pożywki, zaczyna się dzielić (z różną szybkością, zależną od czynników zewnętrznych i od gatunku) i po określonym czasie (zwykle paru dób) wytwarza bardzo liczne zgrupowanie komórek zwane kolonią (kolonią powierzchniową), które jest widoczne gołym okiem. W jednej kolonii znajduje się ok. 109 komórek. Wygląd zewnętrzny kolonii powierzchniowej, czyli jej morfologia, jest charakterystyczny dla danego rodzaju mikroorganizmu, dlatego jest pomocny w jego identyfikacji.

Niektóre gatunki bakterii tworzą dwa typy kolonii: S i R. Kolonie typu S mają gładką powierzchnię (ang. smooth - gładki ), a kolonie R szorstką (ang. rough - szorstki). Jest to związane z różnicami w budowie błony zewnętrznej pokrywającej ścianę komórkową tych bakterii; komórki tworzące kolonie R wykazują braki w kompleksie lipopolisacharydowym (LPS) tworzącym tę błonę. Jako że błona zewnętrzna odpowiada za właściwości chorobotwórcze wielu bakterii (np. pałeczek Salmonella), szczepy tworzące kolonie typu R nie wywołują zakażeń.

Mniej charakterystyczne kolonie powstają, gdy komórka znajdzie się nie na powierzchni, lecz w głębi zestalonej pożywki. Powstają wówczas tzw. kolonie wgłębne, mające zwykle kształt soczewkowaty, z powodu ciśnienia działającego wewnątrz pożywki na dzielące się komórki.












































CZĘŚĆ PRAKTYCZNA


Zadanie 1. Morfologia komórki – wykonanie barwienia prostego błękitem metylenowym


Przygotowanie preparatu i utrwalenie go:


  1. Odtłuścić na sucho szkiełko przedmiotowe pocierając je dość mocno kawałkiem mydła (z jednej strony), po czym usunąć jego resztki czystą szmatką.

  2. Zapalić palnik gazowy i wyżarzyć w płomieniu ezę.

  3. Po ostudzeniu ezy opalić korek i wylot probówki zawierającej zawiesinę bakterii przeznaczoną do barwienia.

  4. Małym palcem tej ręki, która trzyma ezę wyciągnąć korek z probówki i (trzymając go) pobrać ezą hodowlę bakterii.

  5. Opalić wylot probówki i korek, a następnie zamknąć nim probówkę.

  6. Odstawić probówkę do statywu.

  7. Wykonać rozmaz pobranej zawiesiny po odtłuszczonej powierzchni szkiełka.

  8. Odłożyć preparat na ramki wanienki w celu wysuszenia.

  9. Wyżarzyć ezę i odstawić ją do statywu.

  10. Po wyschnięciu preparatu chwycić go pęsetą i trzykrotnie przesunąć nad płomieniem palnika (utrwalanie termiczne).


Barwienie błękitem metylenowym:

.

  1. Odczekać chwilę i zalać utrwalony preparat błękitem metylenowym na 1,5 minuty.

  2. Spłukać wodą i wysuszyć przykładając delikatnie kawałki bibuły.

  3. Umieścić preparat na stoliku mikroskopowym i położyć kroplę olejku imersyjnego na środek preparatu.

  4. Nastawić obiektyw imersyjny (100x) i kręcąc śrubą makrometryczną obniżać go aż do momentu zetknięcia się czoła obiektywu z olejkiem.

  5. Śrubą mikrometryczną nastawić ostrość i obserwować preparat.


Określ morfologię obserwowanych komórek i wykonaj rysunek:



















Zadanie 2. Morfologia komórki – wykonanie barwienia negatywnego

  1. Pobrać dwa szkiełka przedmiotowe i jedno z nich odtłuścić jak w zadaniu 1.

  2. Pobrać sterylną pipetą 1 kroplę zawiesiny bakterii przeznaczonej do barwienia negatywnego i położyć ją na odtłuszczone szkiełko.

  3. Pobrać inną pipetą 1 kroplę tuszu (lub nigrozyny) i położyć ją obok kropli z bakteriami.

  4. Drugim szkiełkiem (jego krótszym brzegiem) zmieszać obie krople i wykonać rozmaz trzymając szkiełko pod kątem ok. 450 i przeciągając wzdłuż pierwszego szkiełka.

  5. Pozostawić preparat do wyschnięcia i oglądać pod imersją


UWAGA! Bakterie barwione tą metodą pozostają żywe. Należy zachować szczególną ostrożność przy obchodzeniu się z preparatem!


Określ morfologię obserwowanych komórek i wykonaj rysunek:












Zadanie 3. Pomiar wielkości komórek bakteryjnych za pomocą okularu mikrometrycznego

(z użyciem instrukcji obsługi okularu)

1.Wycechować mikrometr okularowy, tzn. określić wartość odległości między kreskami

podziałki, za pomocą płytki z podziałką wzorcową (jedna działka na płytce wzorcowej

równa jest 0,01 mm) i obliczyć powiększenie obiektywu (P).

2. Dokonać pomiaru długości komórki bakteryjnej (ΔL = L2 – L1) nastawiając wskaźnik

(środek krzyża) na punkty krańcowe komórki.

3. Obliczyć rzeczywiste wymiary badanej komórki X = ΔL/P




Zadanie 4. Morfologia kolonii

Wybierz dwie różne kolonie spośród wyrosłych na pożywce agarowej na szalce Petriego i opisz ich morfologię uwzględniając: wielkość, kształt, wzniesienie, brzeg, przejrzystość, barwę, strukturę, kształt i wzrost. Opisując kolonie korzystaj z lupy i tablic. Wykonaj rysunki:








mikro 009.jpg

Plik dostępny po zalogowaniu.

mikro 007.jpg

Plik dostępny po zalogowaniu.

MIKROBIOLOGIA laboratorium 14_Różnicowanie pałeczek jelitowych.doc

Podgląd pliku (pełna wersja wyższej jakości po zalogowaniu):

Temat 14: Różnicowanie pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae



Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien:


  • umieć scharakteryzować rodzinę Enterobacteriaceae (wspólne cechy biochemiczne, przykłady rodzajów bakterii i powodowane przez nie choroby)

  • wiedzieć, jakie cechy biochemiczne bada się podczas identyfikacji pałeczek jelitowych,

  • wiedzieć, jakie badania wchodzą w skład szeregu izolacyjnego i szeregu IMVC


Enterobacteriaceae (z gr. enteron - jelito) tworzą obszerną rodzinę pałeczek występujących głównie w jelicie człowieka i zwierząt. Z tego powodu często określa się je mianem pałeczek jelitowych. Są to średniej wielkości gramujemne pałeczki, nieprzetrwalnikujące, ruchliwe lub nieruchliwe, posiadające otoczki lub bezotoczkowe, rosnące na zwykłych podłożach. Ich wspólnymi cechami biochemicznymi są:


  • szybka fermentacja glukozy (także w warunkach beztlenowych)

  • redukcja azotanów do azotynów,

  • ujemna reakcja na oksydazę cytochromową.


Prawie wszystkie pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzają katalazę (enzym rozkładający H2O2). W kwasie DNA tych bakterii suma cząsteczek guaniny i cytozyny (G+C) wynosi 39-59%. Granice między poszczególnymi rodzajami nie są ostre, spotyka się liczne formy przejściowe. Dlatego klasyfikacja tej rodziny nie jest jeszcze ostatecznie ustalona.

Zgodnie z klasyfikacją podaną przez Bergeys Manual of Determinative Bacteriology rodzinę Enterobacteriaceae dzielimy na 5 trybów:


Tryb I – Escherichieae – obejmuje rodzaje: Escherichia, Edwardsiella, Citrobacter,

Salmonella, Shigiella

Tryb II - Klebsielleae - obejmuje rodzaje: Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia

Tryb III – Proteae - obejmuje rodzaj Proteus

Tryb IV –Yersinieae - obejmuje rodzaj Yersinia

Tryb V - Erwinieae - obejmuje rodzaj Erwinia.


Podział na tryby oparto głównie na podobieństwie składu DNA, które jest wyrazem pokrewieństwa mikroorganizmów.

Część pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae powoduje zakażenia przewodu pokarmowego (Shigella wywołująca czerwonkę, czy Salmonella powodująca dur brzuszny lub tzw. salmonellozy, czyli zatrucia pokarmowe), inne zaliczamy do względnie chorobotwórczych lub komensali (mikroorganizmów w zasadzie niechorobotwórczych, które zazwyczaj współżyją z organizmem gospodarza). Jednak przeniknięcie niektórych komensali do miejsc w organizmie, w których normalnie nie występują, może stać się przyczyną niebezpiecznych zakażeń. Szczepy Klebsiella pneumonieae, Escherichia coli (pałeczki okrężnicy), Proteus sp. i inne, mogą spowodować trudne do wyleczenia zakażenia dróg moczowych, oddechowych, posocznice u wcześniaków i noworodków.

Jako że dla większości pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae naturalnym miejscem bytowania jest przewód pokarmowy człowieka i zwierząt, ich obecność w innych miejscach, np. w wodzie, glebie, czy w produktach żywnościowych traktowana jest jako wskaźnik bezpośredniego lub pośredniego zanieczyszczenia fekalnego (kałowego). Przykładem może tu być szerokie stosowanie pałeczki okrężnicy (Escherichia coli) w ocenie stanu sanitarnego wody.

Pałeczki Enterobacteriaceae, poza nielicznymi wyjątkami, nie wykazują większych różnic morfologicznych komórek lub kolonii, umożliwiających odróżnienie rodzajów i gatunków. Różnicowanie w ich obrębie oparte jest głównie na określeniu właściwości biochemicznych badanego szczepu. Analizie takiej poddaje się szczepy bakterii wyizolowane z badanego materiału na podłożach wybiórczo-namnażających (SF, Levin, Mc Conkey, SS, Wilson - Blair). Kryterium zaliczenia pałeczek do określonego rodzaju stanowi zespół właściwości biochemicznych, takich jak:


  • wytwarzanie niektórych metabolitów (indol, H2S),

  • rozkład cukrów i alkoholi (laktoza, mannitol, dulcytol),

  • rozkład aminokwasów (deaminacja, dekarboksylacja),

  • przemiany pewnych związków (mocznik, malonian),

  • aktywność niektórych enzymów (oksydaza, katalaza).


Diagnostykę bakterii z rodziny Enterobacteriaceae poprzedza wykonanie oznaczeń potwierdzających zdolność wyizolowanych szczepów do:

  • wytwarzania oksydazy,

  • fermentacji glukozy i

  • redukcji azotanów.


Następnie należy przystąpić do bezpośredniej identyfikacji bakterii do rodzaju i gatunku, na podstawie schematów biochemicznych. Badania przeprowadza się etapami.

Pierwszy z nich polega na wykonaniu tzw. szeregu izolacyjnego. Składa się on z czterech podłoży diagnostycznych:

  1. wody peptonowej z tryptofanem,

  2. podłoża Kliglera,

  3. laktozy 10% pod parafiną,

  4. podłoża z mocznikiem.


Wzrost bakterii na tych podłożach pozwala na ocenę następujących właściwości:

  1. wytwarzania indolu z tryptofanu,

  2. zdolności do wytwarzania siarkowodoru (H2S),

  3. wytwarzania gazu przy fermentacji węglowodanów,

  4. rozkładu laktozy i mocznika.


Wyniki tych badań są podstawą do zastosowania odpowiedniego szeregu różnicującego w drugim etapie badań.

Etap trzeci, tzw. testy potwierdzające, wykonywany jest tylko w przypadkach wątpliwych, w których nie jest możliwe określenie przynależności taksonomicznej badanego szczepu na podstawie uprzednio przeprowadzonych badań.

Klasyczna diagnostyka drobnoustrojów wymaga zgromadzenia bardzo wielu danych. Jest to praca żmudna, długotrwała i wymagająca zastosowania wielu podłóż i odczynników. Jest to więc badanie drogie. Dlatego w praktyce stosuje się szereg mikrometod ułatwiających i przyśpieszających identyfikację. Metody takie zostały m.in. opracowane dla bakterii będących wskaźnikami stanu sanitarnego, np. szybka identyfikacja pałeczki okrężnicy (Escherichia coli) spośród bakterii grupy coli typu kałowego możliwa jest dzięki tzw. testowi (szeregowi) IMVC. Skrót ten oznacza następujące cztery badania:



  • I – badanie zdolności do wytwarzania indolu z tryptofanu,

  • M – reakcja z czerwienią metylową (tzw. odczynnik MR), która przyjmuje czerwone

zabarwienie przy zakwaszeniu podłoża Clarca w wyniku rozkładu glukozy,

  • V - badanie zdolności do wytwarzania acetylometylokarbinolu (acetoiny) z glukozy

na podłożu Clarca (tzw. reakcja Vogesa-Proskauera),

  • C - badanie zdolności do wykorzystywania cytrynianu jako jedynego źródła węgla.


Typowe szczepy Escherichia coli wytwarzają indol z tryptofanu, rozkładają glukozę z wytworzeniem kwasu, nie wytwarzają acetylometylokarbinolu i nie potrafią korzystać z cytrynianu jako jedynego źródła węgla, a więc w teście IMVC dają wynik: ++ . Wyjątkowo zdarzają się szczepy E. coli indoloujemne i w tedy wynik szeregu IMVC będzie miał postać: + . Według szeregu IMVC identyfikuje się w sposób pewny tylko te bakterie z grupy coli, u których wcześniej stwierdzono, że fermentują laktozę z wytworzeniem kwasu i gazu w temperaturze 440C.

Ważną rolę w badaniach taksonomicznych odgrywa szybkość oznaczenia właściwości biochemicznych drobnoustrojów. Powoduje to tendencję do maksymalnego upraszczania i ograniczania czynności w trakcie diagnostyki. Przykładem tych uproszczeń może być zestaw podłoży Pathotec paper strips oraz Enterotube. Zestaw Pathotec zawiera paski bibuły nasycone odpowiednimi reagentami. Użycie ich pozwala w ciągu kilku godzin oznaczyć takie właściwości szczepu, jak: redukcja azotanów, deaminacja fenyloalaniny, wytwarzanie ureazy, siarkowodoru, dekarboksylacja lizyny, rozkładanie malonianu sodowego i eskuliny.

Zestaw Enterotube zawiera w jednej plastikowej probówce (ang. tube – rurka, probówka) 8 podłoży pozwalających na jednoczesne określenie 11 cech biochemicznych: rozkład glukozy do kwasu i gazu, rozkład laktozy, dulcytolu, deaminacja fenyloalaniny, dekarboksylacja lizyny i ornityny, wytwarzanie siarkowodoru, indolu, rozkład mocznika oraz zdolność wykorzystania cytrynianu jako jedynego źródła węgla. Dodatkową zaletą omawianego zestawu jest łatwość i szybkość posiewu (jednorazowe przeciągnięcie ezy przez wszystkie podłoża) oraz możliwość odczytania wyników nawet przez pomocniczy personel, w oparciu o zamieszczone schematy barwne.

W Polsce produkowany jest zestaw pod nazwą Enteroplast. Są to plastikowe płytki ze studzienkami zawierającymi bezwodne podłoża z substratami różnicującymi. Pozwalają one na oznaczenie 10 cech biochemicznych na podstawie pojawienia się określonego zabarwienia podłoża. Do studzienek wprowadza się zawiesinę badanego szczepu bakterii i poddaje inkubacji w temp. 370C przez 24 godz. W studzienkach bada się następujące reakcje:


  • Fermentacja cukrów. W pięciu studzienkach znajdują się cukry: glukoza, sacharoza, laktoza, rafinoza i mannitol (alkoholowa pochodna glukozy). Jeśli bakterie fermentują dany cukier z wydzieleniem kwasu, to podłoże przyjmuje zabarwienie żółte, z powodu zmiany zabarwienia wskaźnika pH obecnego w studzienkach, reagującego na obniżenie odczynu,

  • Aktywność ureazowa. Aktywność urazowa polega na hydrolizie mocznika z wydzieleniem amoniaku. Jako że amoniak w środowisku wodnym ma odczyn alkaliczny, obecny w podłożu odpowiedni wskaźnik pH zmienia zabarwienie na czerwone jeżeli dojdzie do hydrolizy mocznika.

  • Wytwarzanie siarkowodoru w wyniku redukcji siarczynów. W przypadku powstawania siarkowodoru, reaguje on z obecnymi w podłożu kationami żelaza dając czarny osad siarczku żelaza.

  • Deaminacja fenyloalaniny. Reakcja ta polega na odłączeniu grupy aminowej (deaminacji) od aminokwasu fenyloalaniny. W efekcie powstaje kwas fenylopirogronowy, który z chlorkiem żelazowym FeCl3, dodawanym po inkubacji, daje związek o zabarwieniu zielonym.

  • Powstawanie indolu z tryptofanu. Przekształcenie aminokwasu tryptofanu w indol, wykrywa się przez dodanie do studzienki, po okresie inkubacji, odczynnika Kovacsa. Powstanie różowego zabarwienia świadczy o wyniku dodatnim. Jest to jedna z reakcji (I) z szeregu IMVC.

  • Wzrost na podłożu z cytrynianem jako jedynym źródle węgla. Bakterie zdolne do wzrostu na tym podłożu rozkładają cytrynian, czemu towarzyszy alkalizacja. Obecny w pożywce wskaźnik pH zmienia wówczas barwę na niebieską. Jest to jedna z reakcji (C) z szeregu IMVC.

  • Beztlenowa dekarboksylacja lizyny. Reakcja ta polega na odłączeniu grupy karboksylowej (dekarboksylacji) od aminokwasu lizyny. Przemiana zachodzi w warunkach beztlenowych, stworzonych przez zalanie studzienki sterylną parafiną. W efekcie powstają aminy, które alkalizują podłoże zmieniając jego zabarwienie na fioletowe.

  • Kwaśna fermentacja glukozy. W studzience znajduje się podłoże Clarca z glukozą. Jeżeli badana bakteria rozkłada glukozę z wytworzeniem kwasu, dojdzie do obniżenia odczynu do pH < 4,5. Po dodaniu czerwieni metylowej podłoże zmieni zabarwienie na czerwone. Jest to jedna z reakcji (M) z szeregu IMVC.

Na podstawie uzyskanych reakcji barwnych określa się rodzaj bakterii z rodziny Enterobacteriaceae, korzystając z dołączonych tabel.


Oznaczanie podstawowych cech biochemicznych w tego typu testach pozwala tylko na przybliżoną identyfikację szczepu. Precyzyjne określenie przynależności gatunkowej możliwe jest dopiero po rozszerzonym badaniu biochemicznym i serologicznym (z zastosowaniem specyficznych przeciwciał).


Część praktyczna

Zadanie: Identyfikacja gatunków pałeczek jelitowych na podstawie wybranych testów

biochemicznych

Określić gatunek (rodzaj) badanej bakterii korzystając z tabel identyfikacyjnych, na podstawie wyników reakcji Vogesa-Proskauera, odczynu MR, próby na indol i obserwacji wzrostu bakterii na wybranych pożywkach (podłoża z: cytrynianem sodu, laktozą i z mocznikiem)








MIKROBIOLOGIA_laboratorium_11_Analiza_mikrobiologiczna_POWIETRZA.doc

Podgląd pliku (pełna wersja wyższej jakości po zalogowaniu):

Temat 11: Analiza mikrobiologiczna powietrza


Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien:

wiedzieć, jakie obiekty biologiczne mogą występować w powietrzu oraz jakie czynniki, i jak, na nie działają; wiedzieć, jakie rodzaje zagrożeń wiążą się z obecnością drobnoustrojów w powietrzu; znać i umieć scharakteryzować główne źródła emisji bioaerozolu oraz czynniki wpływające na jego stężenie i rozprzestrzenianie się; znać wady i zalety poszczególnych metod badania zanieczyszczeń mikrobiologicznych powietrza; wiedzieć, jakie drobnoustroje i na jakich pożywkach bada się w ramach sanitarnej analizy powietrza; znać pojęcia: frakcja respirabilna, hemoliza, mikroorganizmy wskaźnikowe, patogeny oportunistyczne; umieć obliczyć stężenie mikroorganizmów w powietrzu (jako jtk/m3) na podstawie liczby wyrosłych kolonii na pożywce i ocenić stopień zanieczyszczenia badanego powietrza.


Powietrze jest środowiskiem niesprzyjającym życiu mikroorganizmów, w którym nie mogą one rosnąć i dzielić się. Jest ono jedynie miejscem ich okresowego przebywania i ośrodkiem umożliwiającym przemieszczanie się. Drobnoustroje dostają się do powietrza w wyniku podmuchów wiatru, porywającego je z różnych środowisk (gleby, wody, odpadów, powierzchni roślin, zwierząt i in.), bądź też są tam aktywnie wyrzucane np. podczas kichania, kaszlu, czy w procesie napowietrzania ścieków. Mikroorganizmy zawieszone w powietrzu można traktować jako układ koloidalny - aerozol biologiczny (tzw. bioaerozol), w którym ośrodkiem rozpraszającym jest powietrze, a fazę rozproszoną tworzą drobnoustroje.

W powietrzu działają 3 podstawowe czynniki ograniczające występowanie mikroorganizmów:

  • brak wystarczającej ilości składników pokarmowych,

  • częsty deficyt wody, grożący wyschnięciem,

  • promieniowanie słoneczne.

Pierwszy z wymienionych czynników w sposób oczywisty uniemożliwia rozwój każdej komórki. Drobnoustroje w powietrzu są ciągle narażone na wyschnięcie, a bez wody niemożliwe są jakiekolwiek procesy życiowe. Niektóre bakterie są szczególnie wrażliwe na deficyt wody i wysuszenie działa na nie bakteriobójczo (np. dwoinki rzeżączki lub krętki kiły giną zaraz po dostaniu się do powietrza). Wiele mikroorganizmów znosi jednak dobrze deficyt wody i, choć nie mogą wtedy normalnie funkcjonować, to w stanie wysuszenia przeżywają miesiące, a nawet lata (przetrwalniki laseczek, zarodniki grzybów).

Promieniowanie słoneczne również działa szkodliwie na drobnoustroje zawieszone w powietrzu, ponieważ powoduje powstawanie mutacji i przyczynia się do wysychania komórek (w wodzie i glebie światło jest zwykle słabe lub nie ma go wcale).


Przystosowanie mikroorganizmów do przebywania w powietrzu

W atmosferze najdłużej mogą przebywać te formy, które ze względu na swoją budowę lub skład chemiczny są odporne na wysychanie i działanie promieniowania słonecznego. Można je podzielić na następujące grupy:

  • formy przetrwalne bakterii,

  • formy wegetatywne bakterii wytwarzające barwniki karotenoidowe lub specjalne warstwy ochronne (otoczki, specjalna budowa ściany komórkowej)

  • zarodniki grzybów,

  • wirusy mające otoczkę.

Oczywiście, oprócz wymienionych form szczególnie odpornych, w powietrzu występują też bardziej wrażliwe komórki i wirusy, ale ich żywotność jest dużo mniejsza. Uważa się, że spośród form wegetatywnych, bakterie gramdodatnie wykazują większą odporność niż gramujemne (zwłaszcza na wysuszenie), ze względu na grubszą ścianę komórkową. Poza tym, wirusy są zwykle bardziej odporne niż bakterie.


Przeżywalność i rozprzestrzenianie się bioaerozoli

Drobnoustroje po opuszczeniu swojego pierwotnego miejsca zasiedlenia i przedostaniu się do powietrza, są nagle poddane działaniu licznych czynników niesprzyjających przeżyciu i część z nich ginie od razu, głównie z powodu wysuszenia. Te, które przeżyją stres nagłej zmiany warunków życia, są jednak nadal poddawane ich działaniu i z czasem zamierają. Na przeżywalność mikroorganizmów w powietrzu wpływają następujące czynniki:

  • odporność właściwa dla danego drobnoustroju,

  • warunki meteorologiczne (m.in. wilgotność względna, temperatura, promieniowanie słoneczne),

  • zanieczyszczenia powietrza,

  • czas przebywania w powietrzu.

Jednym z głównych czynników warunkujących przeżywalność jest zawartość wody w powietrzu. Przy bardzo niskiej wilgotności i wysokiej temperaturze komórkom grozi wysuszenie, natomiast wysoka wilgotność może chronić komórki przed napromieniowaniem, poprzez jego absorpcję. Drobnoustroje różnie reagują na stopień wilgotności powietrza, choć dla większości z nich korzystniejsze warunki przetrwania stwarza wysoka wilgotność.

Temperatura może działać pośrednio, poprzez zmianę wilgotności względnej powietrza (im wyższa temperatura, tym niższa wilgotność względna) lub bezpośrednio, powodując w skrajnych przypadkach wysuszenie komórek i denaturację białek (temperatury wysokie) albo krystalizację wody zawartej w komórkach (temperatury poniżej 0oC). Wynika z tego, że optymalne dla bioaerozolu są temperatury niskie, ale powyżej 0oC. (według niektórych badaczy ok. 15oC).

Promieniowanie słoneczne ma negatywny wpływ na przeżywalność bioaerozolu, zarówno jako światło widzialne, jak i promieniowanie podczerwone i ultrafioletowe (UV). Jest tak z następujących przyczyn:

  • powoduje ono powstawanie mutacji,

  • powoduje powstawanie wolnych rodników, które uszkadzają ważne makromolekuły,

  • stwarza zagrożenie wysuszeniem.

Obecne w powietrzu zanieczyszczenia, zwłaszcza węglowodory, ozon i tlenki azotu, aktywowane promieniowaniem słonecznym (szczególnie UV) tworzą różnorodne, silnie reaktywne zanieczyszczenia wtórne, określane ogólnie jako utleniacze fotochemiczne (m.in. azotan peroksyacetylu - PAN). Działają one toksycznie na wszelkie formy życia, w tym i na mikroorganizmy zawieszone w powietrzu. Natomiast nietoksyczne aerozole niebiologiczne (pyły, mgły), rozpraszają i absorbują promieniowanie słoneczne i przez to zwiększają szansę przeżycia bioaerozolu.

Należy zaznaczyć, że omówione wyżej czynniki działają równocześnie i często są ze sobą

powiązane, np. promieniowanie słoneczne zwiększa temperaturę, a wysoka wilgotność osłabia promieniowanie.


Stężenie mikroorganizmów w powietrzu


O stężeniu bioaerozolu, czyli stopniu zanieczyszczenia mikrobiologicznego powietrza, decydują m. in. następujące czynniki:

  • wielkość emisji drobnoustrojów, zależna od źródła emisji,

  • odległość od źródła emisji,

  • prędkość wiatru,

  • przeżywalność drobnoustrojów (zależna od czynników omówionych wyżej),

  • opady atmosferyczne.

Wielkość emisji i skład gatunkowy emitowanego bioaerozolu zależy od źródła emisji. Różne mogą być czynniki wpływające na stężenie początkowe powstającego bioaerozolu. Np. dla komory napowietrzania biologicznej oczyszczalni ścieków są to m. in.: stężenie mikroorganizmów w ściekach i sposób ich napowietrzania.

Powstały bioaerozol rozprzestrzenia się podobnie jak aerozol niebiologiczny (np. pył zawieszony) z tą różnicą, że mikroorganizmy z czasem zamierają. Wiejący wiatr rozrzedza aerozol i powoduje, że jego stężenie na zawietrznej od źródła emisji spada wraz z oddalaniem się od niego. Dodatkowymi czynnikami zmniejszającymi stężenie bioaerozolu jest grawitacja, działająca głównie na większe cząstki, i opady atmosferyczne, niekiedy radykalnie redukujące stężenie aerozolu (po intensywnych opadach deszczu lub śniegu, powietrze jest praktycznie wolne od drobnoustrojów).


Zagrożenia związane z obecnością drobnoustrojów w powietrzu

Można wyróżnić następujące grupy zagrożeń:

  • Choroby zakaźne: wirusowe, bakteryjne, grzybowe i pierwotniacze,

  • Choroby alergiczne,

  • Zatrucia (np. endotoksyny i mikotoksyny).

Główne źródła emisji bioaerozolu

Można wyróżnić dwa podstawowe źródła bioaerozolu:

  • naturalne

  • bytowe (związane z działalnością człowieka)

Źródła naturalne to przede wszystkim gleba i woda, z których mikroorganizmy są wynoszone przez ruchy powietrza, a także organizmy, np. grzyby emitujące olbrzymie ilości zarodników roznoszonych przez wiatr. A więc w powietrzu istnieje zawsze pewna liczba drobnoustrojów tworząca naturalne tło.

Z higienicznego punktu widzenia, ważniejsze od naturalnych są bytowe źródła bioaerozolu, związane z działalnością człowieka. Emisje z tych źródeł są niebezpieczne z dwóch powodów:

  • mogą rozprzestrzeniać drobnoustroje patogenne (chorobotwórcze),

  • często powodują silne zwiększenie liczebności mikroorganizmów w powietrzu, znacznie przekraczające naturalne tło.

Źródła emisji aerozolu biologicznego mogą mieć charakter punktowy (np. komora napowietrzania ścieków) lub powierzchniowy (np. pole nawadniane ściekami).

Do najważniejszych źródeł bioaerozolu należą:

  • rolnictwo i przemysł rolno-spożywczy,

  • oczyszczanie ścieków,

  • gospodarka odpadami (składowiska i kompostownie),


Rolnictwo i przemysł rolno-spożywczy

Pod względem wielkości emisji jest to najpoważniejsze źródło bioaerozolu, będące efektem intensyfikacji metod produkcji rolnej. Aerozol powstaje podczas wykonywania większości prac rolniczych, np. zbioru plonów, w czasie transportu, przechowywania i przerobu surowców roślinnych i zwierzęcych, oraz w pomieszczeniach hodowlanych.

Do najważniejszych składników tego aerozolu należą:

  • grzyby pleśniowe, m. in. tzw. grzyby przechowalniane (Aspergillus, Penicillium) i tzw. grzyby polowe (Cladosporium i Alternaria), najpospolitsze grzyby w powietrzu,

  • pałeczki gramujemne, głównie z rodzaju Ervinia,

  • promieniowce termofilne,

  • pył pochodzenia biologicznego (m. in. fragmenty naskórka, pierza, cząstki wydalin i pył roślinny).

Ekspozycja na taki aerozol często powoduje przewlekłe choroby układu oddechowego, np. alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych.

Oczyszczanie ścieków

Wielkość emisji bioaerozolu zależy tu m. in. od składu ścieków, przepustowości oczyszczalni, metody oczyszczania i rodzaju stosowanych urządzeń technologicznych. Sprzyjające warunki do tworzenia się bioaerozolu powstają zwłaszcza przy wylewaniu ścieków, ich napowietrzaniu, mieszaniu i rozpryskiwaniu. Skład jakościowy powstałej mikroflory powietrza jest ściśle związany ze składem oczyszczanych ścieków.

Za najbardziej specyficzne dla bioaerozoli ściekowych uważa się bakterie jelitowe (pałeczki z grupy coli, pałeczki durowe) i wirusy jelitowe, gdyż zazwyczaj nie spotyka się ich w powietrzu po stronie nawietrznej oczyszczalni. Z tego powodu uważa się je za mikroorganizmy wskaźnikowe, pomocne w wyznaczaniu strefy oddziaływania oczyszczalni na środowisko.

Gospodarka odpadami

Źródłem emisji bioaerozolu są różne formy gospadarki odpadami m. in.: składowanie odpadów i kompostownie.

Składowanie odpadów

W powietrzu wokół składowisk występują głównie pospolite w przyrodzie bakterie i grzyby saprofityczne pochodzenia glebowego i wodnego, z których część ma charakter patogenów oportunistycznych. Oznacza to, że w sprzyjających warunkach (osłabienie układu odpornościowego, wniknięcie do organizmu w dużej ilości) mogą one wywołać u człowieka stan chorobowy. Dobrymi mikroorganizmami wskaźnikowymi oddziaływania składowisk na otoczenie są grzyby ciepłolubne (rosnące w temp. 37oC) i keratynolityczne (rozkładające keratynę).

Kompostownie

Kompostownie również emitują duże ilości drobnoustrojów, zwłaszcza bakterii. Szczególnie duże zanieczyszczenie powietrza powstaje przy sortowaniu odpadów, gdzie liczne są bakterie gramujemne, potencjalnie niebezpieczne dla człowieka. Dobrym wskaźnikiem oddziaływania kompostowni na otoczenie jest pospolity w kompoście grzyb pleśniowy - kropidlak popielaty (Aspergillus fumigatus).


Wykrywanie obecności drobnoustrojów w powietrzu

Stosowane metody można podzielić umownie na:
  • mikroskopowe

  • hodowlane.

Niekiedy stosowane metody mają charakter pośredni lub używa się jednocześnie obu metod.


Metody mikroskopowe

Polegają one na:

  • przepuszczaniu powietrza przez filtr membranowy bądź umieszczaniu na drodze zasysanego powietrza szkiełka powleczonego lepką substancją (np. wazeliną),

  • barwieniu wyłapanych drobnoustrojów i

  • badaniu mikroskopowym, polegającym głównie na liczeniu komórek.

Zalety metod mikroskopowych są następujące:

  • możliwość wykrycia w powietrzu nie tylko żywych, ale i martwych mikroorganizmów,

  • możliwość wykrycia także tych drobnoustrojów, które niechętnie wyrastają na pożywkach; dzięki temu oznaczenia liczby drobnoustrojów są zwykle przynajmniej o rząd wielkości wyższe, niż w metodach hodowlanych,

  • można wykryć i zidentyfikować inne obiekty biologiczne, np.: pyłki roślin, alergogenne roztocze, nieożywiony pył organiczny ( fragmenty naskórka, piór, roślin)

Jednak metody te mają poważną wadę: niemożność identyfikacji gatunkowej mikroorganizmów (bakterii, grzybów, wirusów).


Metody hodowlane

Metody te polegają na przeniesieniu mikroorganizmów z powietrza na powierzchnię odpowiedniej pożywki. Po okresie inkubacji w optymalnej temperaturze, liczy się wyrosłe kolonie i podaje wynik jako liczbę jednostek tworzących kolonie przypadających na 1 m3 powietrza (jtk/m3 lub cfu/m3 - z ang. colony forming units – jednostki tworzące kolonie). Jako że kolonia może powstać nie tylko z jednej, ale i z kilku połączonych komórek, w rzeczywistości w powietrzu może się znajdować więcej mikroorganizmów, niż wskazuje na to wynik wyrażony w jednostkach jtk (cfu). Poza tym, za pomocą metod hodowlanych można wykryć jedynie żywe komórki i tylko te, które są w wstanie wyrosnąć na stosowanych pożywkach.

Można wyróżnić trzy podstawowe sposoby pobierania prób powietrza stosowane w metodach hodowlanych:

  • metoda sedymentacyjna Kocha,

  • metody filtracyjne (stosowane również w metodach mikroskopowych),

  • metody zderzeniowe (impakcyjne).

Metoda sedymentacyjna

Jest to najprostsza metoda i polega na opadaniu komórek z powietrza na odkryte szalki Petriego z odpowiednią pożywką. Siła grawitacji działająca na cząstki bioaerozolu ma znaczenie jedynie w stosunku do większych cząstek, natomiast mniejsze uderzają w eksponowaną pożywkę pod wpływem ruchów powietrza. Po określonym czasie ekspozycji (zwykle 10 lub 30 min.) płytki inkubuje się i liczy wyrosłe kolonie.

Zaletą tej popularnej metody jest, oprócz prostoty, jej poręczność i taniość. Można ją jednak stosować jedynie do orientacyjnego określania liczby mikroorganizmów w powietrzu, oraz do badań porównawczych, ponieważ ma ona szereg wad. Należą do nich:

  • nieznajomość objętości powietrza, do której należy odnieść stwierdzoną wartość jtk (cfu),

  • niemożność wykrycia najdrobniejszych cząstek, które osiadają bardzo wolno lub w ogóle nie ulegają sedymentacji (niska wydajność metody),

  • duża niedokładność, powodowana przez ruchy powietrza zmieniające warunki sedymentacji.

Pierwsza z wymienionych wad jest częściowo rekompensowana stosowaniem empirycznego wzoru przeliczeniowego, opartego na założeniu, że w ciągu 5 minut na powierzchnię 100 cm2 opadają komórki znajdujące się w 10 dm3 powietrza. Wzór ma następującą postać:


a 5 104

x =

r2 t

gdzie: x - liczba mikroorganizmów w powietrzu (w jtk/m3 lub cfu/m3),

a - liczba kolonii wyrosłych na płytce Petriego,

r2 – pole powierzchni płytki Petriego (w cm2),

t - czas ekspozycji w minutach (w min.).


Aby ograniczyć zaburzenia związane z ruchami powietrza, zaleca się, aby badania prowadzić przy słabym wietrze.

Metody aspiracyjne (filtracyjne)

Metody te są również stosunkowo tanie i proste, ale mają dwie zasadnicze zalety w porównaniu z metodą sedymentacyjną:

  • znana jest objętość badanego powietrza,

  • można wykryć również drobne cząstki zanieczyszczeń mikrobiologicznych, tworzące tzw. frakcję respirabilną, zdolną przenikać do płuc (choć nie można określić jej wielkości).

Metody te polegają na zassaniu przez pompę (aspirator) znanej objętości powietrza, przepuszczeniu go przez sterylną substancję pochłaniającą (ciekłą lub stałą) i przeniesieniu odfiltrowanych drobnoustrojów na odpowiednią pożywkę. Po określonym czasie inkubacji liczy się wyrosłe kolonie. Najczęściej do filtracji powietrza stosuje się roztwór fizjologiczny (0,85 % NaCl) lub filtry membranowe.

Filtracja przez płyny (klasyfikowana niekiedy jako metoda zderzeniowa) jest jedną z najczęściej stosowanych i wysoko cenionych technik pobierania bioaerozolu. Wynika to nie tylko z jej poręczności, ale też z dużej wydajności. Oznacza to zarówno dużą wydajność pobierania bioaerozolu (w tym frakcji respirabilnej), jak i znaczną przeżywalność pobranych mikroorganizmów.

Filtracja przez filtry membranowe umożliwia użycie zarówno metody hodowlanej (filtry z drobnoustrojami kładzie się bezpośrednio na pożywkę lub płucze się je, a następnie posiewa), jak i mikroskopowej (filtry barwi się i ogląda pod mikroskopem). Jednak wadą tej techniki jest stosunkowo niewielka wydajność, wynikająca z oporów przepływu powietrza powstających podczas przepuszczania go przez drobne pory filtra, i mała poręczność.


Metody zderzeniowe

Polegają one na zasysaniu przez aspirator znanej objętości powietrza, które z dużą szybkością uderza w powierzchnię pożywek agarowych. Powoduje to przyklejanie się obecnych w powietrzu drobnoustrojów, które po określonym czasie inkubacji wytwarzają kolonie. Metody zderzeniowe, zwane też impakcyjnymi (od ang. impact - zderzenie) są najwyżej cenionymi i coraz częściej stosowanymi metodami wykrywania mikroorganizmów w powietrzu. Ich największą zaletą jest możliwość wykrycia i określenia wielkości frakcji respirabilnej. Poza tym metody te nadają się do badania wirusów.

Wadą metod zderzeniowych jest spadek żywotności drobnoustrojów spowodowany szokiem związanym z nagłym uderzeniem o pożywkę agarową oraz możliwość zarastania pożywek w przypadku silnego zanieczyszczenia powietrza. Poza tym zwykle nie są to metody tanie.

Mikrobiologiczna ocena stanu sanitarnego powietrza

Ocena stanu sanitarnego powietrza obejmuje aspekt ilościowy i jakościowy, i zależy od rodzaju ocenianego powietrza. Inne kryteria stosuje się do powietrza atmosferycznego, a inne do powietrza wewnątrz różnego typu pomieszczeń. Wartości bezpiecznych stężeń podawane przez różnych autorów różnią się. Według norm przyjętych w Polsce powietrze atmosferyczne jest czyste, jeśli zagęszczenie komórek bakterii mezofilnych nie przekracza 1000 jtk/m3, a grzybów mikroskopowych 3000 jtk/m3.

Wewnątrz pomieszczeń mieszkalnych ogólna liczba bakterii mezofilnych nie powinna przekraczać 2000 jtk/m3, a grzybów 300 jtk/m3.

Jeśli zagęszczenie mikroorganizmów przekracza podane wartości, lub w skład aerozolu wchodzą drobnoustroje niebezpieczne dla człowieka, to takie powietrze uważa się za zanieczyszczone mikrobiologicznie.

Dla pomieszczeń użytkowych dopuszczalne wartości graniczne zależą od ich przeznaczenia, np. na sali operacyjnej nie może być w ogóle grzybów a liczba bakterii nie może przekraczać 100 cfu/m3. Natomiast np. w chlewni dopuszcza się stężenie bakterii wynoszące 200000 cfu/m3, a grzybów 10000 cfu/m3.

Bardzo ważna z higienicznego punktu widzenia jest znajomość wielkości frakcji respirabilnej bioaerozolu. Im większy jest jej udział procentowy, tym większe zagrożenie dla zdrowia stwarza powietrze, nawet jeśli nie ma w nim mikroorganizmów wywołujących choroby zakaźne. Wdychanie takiego powietrza może bowiem być powodem alergii, zatruć i pylic.

Badania jakościowe z konieczności muszą być ograniczone do mikroorganizmów wskaźnikowych, bowiem identyfikacja drobnoustrojów chorobotwórczych jest zwykle żmudna i droga. Gatunki wskaźnikowe same nie muszą być chorobotwórcze, ale ich występowanie wskazuje pośrednio na potencjalne zagrożenie mikroorganizmami patogennymi.

Do stosowanych w sanitarnej analizie powietrza mikroorganizmów wskaźnikowych należą m. in.:

  • gronkowce hemolizujące,

  • gronkowce mannitolododatnie i mannitoloujemne,

  • promieniowce,

  • pałeczki Pseudomonas fluorescens.


Gronkowce to jedne z najpospolitszych bakterii w przyrodzie. Nie wszystkie są chorobotwórcze, wiele z nich występuje na skórze i błonie śluzowej człowieka nie powodując chorób. Gatunki chorobotwórcze wykazują wysoką aktywność metaboliczną, dzięki której można je odróżnić od niechorobotwórczych.

Gronkowce chorobotwórcze wywołują m. in.:

  • całkowitą hemolizę krwinek czerwonych (erytrocytów) na agarze z krwią,

  • kwaśną fermentację mannitolu na podłożu Chapmana.


Hemoliza polega na rozkładzie erytrocytów (krwinek czerwonych) przez pewne toksyny produkowane przez bakterie, co przejawia się powstawaniem charakterystycznych przejaśnień wokół kolonii.

Podłoże Chapmana zawiera 10% NaCl, co powoduje, że wyrastają na nim głównie gronkowce, odporne na duże stężenie soli. Obecność w podłożu mannitolu (wielowodorotlenowego alkoholu) pozwala zróżnicować gronkowce na mannitolododatnie (zdolne do fermentacji mannitolu) i mannitoloujemne (niezdolne). Stwierdzenie hemolizy i fermentacji mannitolu zwiększa prawdopodobieństwo, że wykryte gronkowce są chorobotwórcze.

Promieniowce to typowe bakterie glebowe. W przeciwieństwie do innych bakterii, komórki promieniowców mają często postać rozgałęziających się nitek i mogą tworzyć tzw. pseudogrzybnię, podobnie jak strzępki grzybów. Z tego powodu wytwarzają one charakterystyczne meszkowate kolonie na podłożu Pochona. Wiele promieniowców ma zdolność wytwarzania antybiotyków (promieniowcowym antybiotykiem jest np. streptomycyna). Obecność promieniowców w powietrzu może wskazywać na środowisko glebowe jako źródło zanieczyszczenia powietrza.

Bakteria Pseudomonas fluorescens jest pospolitą bakterią wodną. Na podłożu Kinga B wytwarza ona barwniki fluoryzujące powodujące świecenie kolonii w świetle UV. Obecność tych bakterii w powietrzu może wskazywać na środowisko wodne jako źródło zanieczyszczenia.

Poza tym w badaniu zanieczyszczenia mikrobiologicznego powietrza wokół określonego emitora, wykorzystuje się gatunki charakterystyczne dla tego emitora. Pozwala to na wyznaczenie strefy jego oddziaływania na stan sanitarny powietrza – granicę oddziaływania będzie wyznaczał obszar występowania mikroorganizmu wskaźnikowego.















CZĘŚĆ PRAKTYCZNA


Zadanie 1. Badanie zanieczyszczenia mikrobiologicznego powietrza za pomocą metody

sedymentacyjnej

Na wyznaczonych 4 stanowiskach poboru prób ustawić szalki Petriego z: agarem odżywczym, pożywką Sabouraud’a, Chapmana, Pochona i Kinga B. Otworzyć szalki stosując następujące czasy ekspozycji:

  • 10 min. dla agaru odżywczego i podłoża Sabouraud’a,

  • 30 min. dla pozostałych pożywek.

Po ekspozycji, pożywki inkubować w następujących temperaturach:

  • agar odżywczy i podłoże Chapmana – w temp. 370C,

  • podłoża: Sabouraud’a, Pochona i Kinga B – w temp. 260C.

Po okresie inkubacji, policzyć kolonie wyrosłe na poszczególnych pożywkach. Na podłożu Sabouraud’a należy policzyć wszystkie kolonie, na agarze odżywczym – wszystkie, oprócz kolonii grzybowych, na podłożu Chapmana – policzyć oddzielnie kolonie mannitolododatnie i mannitoloujemne, na podłożu Pochona – tylko charakterystyczne mechowate kolonie promieniowców, a na podłożu Kinga – wyłącznie kolonie wykazujące fluorescencję w świetle UV.

W celu obliczenia zagęszczenia mikroorganizmów w jednostce objętości powietrza (w 1 m3 ), otrzymane wyniki (liczby wyrosłych kolonii) podstawić do wzoru:


a 5 104

x =

r2 t

gdzie: x - liczba mikroorganizmów w powietrzu (w jtk/m3 lub cfu/m3),

a - liczba kolonii wyrosłych na płytce Petriego,

r2 – pole powierzchni płytki Petriego (= 100 cm2),

t - czas ekspozycji (w minutach)


Obliczone zagęszczenia zamieścić w tabeli:





Stano-

wisko

Agar

odżywczy

-ogólna liczba

bakterii

Podłoże

Sabouraud’a

-ogólna liczba

grzybów

Podłoże

Chapmana

- gronkowce

man+ man-

Podłoże

Pochona

- promieniowce

Podłoże

Kinga B

- Pseudomonas

fluorescens

1







2







3







4









Zadanie 2. Określanie stopnia zanieczyszczenia mikrobiologicznego w różnych odległościach od emitora, na przykładzie oczyszczalni ścieków i składowiska odpadów.


1. Policzyć kolonie wyrosłe na poszczególnych podłożach eksponowanych w różnych

odległościach od emitora

2. Obliczyć zagęszczenie mikroorganizmów w 1 m3 powietrza (jak w zad.1)

3. Ocenić stopień zanieczyszczenia powietrza w poszczególnych punktach

4. Określić strefę oddziaływania emitora na środowisko porównując zagęszczenie

mikroorganizmów w badanych punktach pomiarowych do zagęszczenia w punkcie

kontrolnym (na nawietrznej)



mikro 012.jpg

Plik dostępny po zalogowaniu.

mikro 005.jpg

Plik dostępny po zalogowaniu.

Zagadnienia- Mikrobilogia.doc

Podgląd pliku (pełna wersja wyższej jakości po zalogowaniu):
Zagadnienia:

Zagadnienia:

  1. Opisać fotosyntezę bakterii

  2. Typy wzrostu na pożywkach płynnych

  3. Taksonomia naturalna i sztuczna

  4. Flokulacja osadu czynnego

  5. Bakterie chorobotwórcze w wodach.

  6. Opisać ścianę komórkową u bakterii

  7. Budowa i funkcje rzęsek i fimbrii

  8. Procesy fermentacyjne z drobnoustrojami

  9. Rozmnażanie u bakterii

  10. Rola wrotków w osadzie czynnym.

  11. Drobnoustroje chorobotwórcze w powietrzu

  12. Etapy analizy bakteryjnej ścieków

  13. Od czego zależy równowaga wody wodociągowej

  14. Budowa i funkcje rybosomów

  15. Na czym polega mechanizm utlenienia zredukowanych związków mineralnych

  16. Różnice w fotosyntezie bakterii i roślin

  17. Mikroflora w powietrzu

  18. Analiza mikrobiologiczno- helmintologiczna gleby

  19. Źródła pierwiastków podstawowych.

  20. Rodzaje i funkcje przetrwalników bakterii

  21. Transdukcja

  22. Budowa ściany komórkowej bakterii

  23. Konsekwencje puchnięcia osadu czynnego

  24. Bakterie nitryfikacyjne

  25. Patogenność Shigella

  26. Naturalne oczyszczanie ścieków

  27. Budowa rybosomu

  28. Na czym polega wykrycie miana coli w wodzie?

  29. Sposób przechowywania szczepu bakterii

  30. Sposób pobierania pokarmu przez bakterie

  31. Denitryfikacja

  32. Pierwotniaki chorobotwórcze w wodzie.

  33. Etapy analizy mikrobiologicznej wody

  34. Właściwości bakterii Shingena

  35. Biocenoza osadu czynnego

  36. Właściwości chorobotwórcze bakterii z rodzaju Salmonella

  37. Fotosynteza bakteryjna

  38. Mikroflora powietrza

  39. Scharakteryzować Clostridium perfringers

  40. Rodzaje i właściwości przetrwalników bakterii

  41. Rola pierwotniaków w osadzie czynnym

  42. Opisać bakterie E. coli

  43. Opisać test IMVC

  44. Skład chemiczny komórek

  45. Koniugacja bakterii

  46. Analiza sanitarna gleby

  47. Jak zmierzyć/zbadać obecność stężenie/ ilość mikroorganizmów w 1 m3 powietrza

  48. Kiedy osad czynny działa poprawnie a kiedy źle?

  49. Bakterie asymilujące azot atmosferyczny

  50. Morfologia grzybów pleśniowych.

  51. Zasada działania biofiltra

  52. Ściana bakterii gramujemnych

  53. Bakterie żelaziste

  54. Rozkład heksoz do pirogronianu

  55. Represja kataboliczna

  56. Charakterystyka purpurowych bakterii siarkowych

  57. Taksonomia naturalna i sztuczna

  58. Od czego zależy dezynfekcja wody?

  59. Typy oddychania beztlenowego u bakterii.

  60. Wymienić główne źródła bioaerozoli

  61. Rozpowszechnianie i przeżywalność mikroorganizmów

62. Co to są plazmidy?

  1. Proces transkrypcji i translacji u eukariota

  2. Budowa otoczki bakteryjnej

65. Bakterie przenoszone drogą wodną.

1. Fotosynteza bakterii:

Autotroficzny sposób odżywiania się roślin, sinic oraz niektórych bakterii (zielone i purpurowe). W procesie fotosyntezy przy udziale energii świetlnej z prostych związków mineralnych tworzą się związki organiczne. Warunkiem fotosyntezy jest obecność barwników fotosyntetycznie czynnych, głównie chlorofilu, a u bakterii - bakteriochlorofilu. U roślin fotosynteza przebiega w chloroplastach, które najliczniej występują w miękiszu asymilacyjnym w liściach. Uproszczone równanie fotosyntezy: 6CO2 + 6H2O → C6H12O6 + 6O2. Obejmuje dwie fazy: jasną (zależną od światła), która zachodzi w błonach gran i ciemną (niezależną bezpośrednio od światła) - przebiegającą w stromie chloroplastów.

2. Fazy wzrostu na pożywkach płynnych.

- faza zastoju : zaszczepione komórki początkowo nie rozmnażają się, lecz adaptują do nowych warunków (skład pożywki, pH i inne); zachodzi w niej intensywna synteza RNA białka i wzrasta liczba rybosomów, w efekcie komórki zwiększają rozmiary; faza ta trwa od zaszczepienia do ustalenia się maksymalnej szybkości podziałów; końcowy jej etap to tzw. etap młodości fizjologicznej (największe rozmiary i rozpoczęcie podziałów); czas jej trwania zależy od rodzaju inokulum (jego wielkości i wieku) i od stopnia dopasowania do niego pożywki i parametrów hodowli; w przypadku zastosowania dwóch różnych źródeł węgla mogą pojawić się dwie fazy lad (diauksja);

faza wzrostu logarytmicznego : w fazie tej liczba bakterii wzrasta w postępie geometrycznym, stąd logarytm liczby bakterii jest proporcjonalny do czasu hodowli; wzrost jest zrównoważony, bo wielkość komórek i ich skład nie ulegają zmianie (tzw. komórki standardowe); komórki dzielą się z maksymalną szybkością zależną od rodzaju podłoża, temperatury i właściwości bakterii; pod koniec gdy stężenie substratu jest już małe, faza log przechodzi w fazę zwolnionego wzrostu (spada synteza RNA i białek, komórki zmniejszają się);

faza stacjonarna : następuje po okresie zwolnionego wzrostu i cechuje się stałą liczbą żywych komórek; odbywające się jeszcze sporadycznie podziały równoważą ubytki spowodowane zamieraniem; w fazie równowagi hodowla zawiera najwięcej biomasy (maksymalny tzw. plon, wydajność); substrat ulega wyczerpaniu, gromadzą się (toksyczne) wtórne metabolity i spada ilość tlenu; wielkość komórek staje się niejednolita, a ich kształt może ulegać zmianom; w biotechnologii idiofaza jest wykorzystywana do produkcji ważnych metabolitów wtórnych, np. antybiotyków;
faza zamierania : wzrasta liczba martwych komórek (podziały są bardzo rzadkie lub całkowicie ustają); pojawiają się procesy autolizy; w efekcie ogólna biomasa hodowli zmniejsza się; czasami zachodzi gwałtowny spadek liczby komórek (śmierć logarytmiczna); zwykle jednak nawet w bardzo starych hodowlach pozostają komórki zdolne do wzrostu i rozmnażania (wyjątkiem są hodowle pewnych wrażliwych gatunków, np. gonokoków, w których dochodzi do samo wyjałowienia hodowli);

3. Taksonomia naturalna i sztuczna.

Celem taksonomii naturalnej jest określenie pokrewieństwa między klasyfikowanymi organizmami. Analizuje się kwasy nukleinowe.

Taksonomia sztuczna porządkuje mikroorganizmy na podstawie podobieństwa cech fenotypowych.

4. Flokulacja osadu czynnego.

Inaczej proces tworzenia się kłaczków, zachodzi spontanicznie w trakcie napowietrzania komory wypełnionej ściekami.

W oczyszczalniach pracujących metodą osadu czynnego ścieki, po oczyszczaniu mechanicznym w osadniku wstępnym, są kierowane do komory osadu czynnego, zwanej też komorą napowietrzania, gdzie odbywa się właściwe oczyszczanie biologiczne. Kłaczki osadu wchodzą tu w kontakt ze ściekami w warunkach sztucznego napowietrzania i intensywnego mieszania. Bakterie obecne w kłaczkach pochłaniają substancję organiczną ze ścieków i część jej zużywają jako paliwo (źródło energii), część natomiast przyswajają jako materię budulcową, co prowadzi do zwiększenia biomasy. Efektem tych procesów jest mineralizacja ścieków i wzrost masy osadu czynnego.

6. Opisać ścianę komórkową u bakterii gramdodatnich i gramujemnych.

Ściana komórkowa bakterii gram dodatnich

  • Mureina stanowi 30-70 % suchej masy ściany komórkowej, składa się z około 40 warstw

  • Do murein przyłączone są też różne kwasy tejchojowe

Ściana komórkowa bakterii gram ujemnych

  • sieć mureiny jest jednowarstwowa i stanowi mniej niż 10% suchej masy ściany komórkowej

  • w ścianie bakterii gramujemnych nie wykryto kwasów tejchojowych.

  • Część dominującą ściany stanowi warstwa plastyczna, którą tworzy błona zewnętrzna zbudowana z fosolipidów, białek

  • Białka o funkcji transportowej tworzą w błonie kanały wypełnione wodą, które pozwalają na wniknięcie do komórki niskocząsteczkowych substancji hydrofilowych

  • Między błoną zewnętrzną a mureiną znajduje się tzw. przestrzeń peryplazmatyczna, która zawiera znaczną ilość enzymów

7. Rzęski i fimbrie

Rzęski to wyrostki które składają się z 3 części: włókna, ciałka podstawowego i haka łączącego obie części. Maja kształt lekko skręconej spirali o równej grubości na całej długości i składają się z heliakalnie zwiniętych łańcuchów kurczliwego białka zwanego flagelliną. Rzęska działa jak śruba napędowa a jej ruchy mogą odbywać się zgodnie lub niezgodnie ze wskazówkami zegara.

Fimbrie- występują wyłącznie u bakterii, zakotwiczone w cytoplazmie nitkowate wyrostki, są znacznie mniejsze, sztywniejsze i delikatniejsze od rzęsek bakteryjnych. Zbudowane są z białka zwanego piliną, Cienkie fimbrie ułatwiają przyczepianie komórek do podłoża oraz między sobą.


10. Rola wrotków w osadzie czynnym.

Wrotki zajmują w osadzie czynnym najwyższy poziom troficzny i rozwijają się w ostatnim etapie flokulacji. Ich obecność w osadzie zwykle świadczy o jego dobrym natlenieniu i jego stabilizacji, są bioindykatorami dobrego przebiegu oczyszczania ścieków, w ściekach bardziej obciążonymi przemysłowymi odpadami wrotków nie spotyka się wcale. Wrotki zjadają także populacje bakteryjne, dzięki czemu następuje odmładzanie flory bakteryjnej i zwiększają jej aktywność metaboliczną. Przyczyniają się także do klarowania ścieków, poprzez zjadanie bakterii powodujących zmętnienie oczyszczanych ścieków. Wytwarzany przez wrotki śluz pomaga zlepianiu się w kłaczki substancji zanieczyszczających ścieki.

13. Od czego zależy równowaga wody wodociągowej?

Stabilność wody wodociągowej, oznacza to, że mikroorganizmy nie mają szansy na wtórny rozwój, po wcześniejszym uzdatnianiu, w takie wodzie. Stabilność ta zależy od doboru procesów i parametrów technologicznych, aby jak najskuteczniej usunąć z niej nieorganiczne i organiczne substraty podatne na biodegradację, będące źródłem energii dla mikroorganizmów. Przyczynami niestabilności może być stagnacja (zastój) wody w sieci wodociągowej, niska jakość wody, którą wprowadza się do sieci wodociągowej, mało efektywne procesy uzdatniania wody, wtórne skażenia poprzez zły stan techniczny sieci, niewłaściwą konstrukcję, użyte materiały.
Stabilność wody wodociągowej zależy także od rodzajów dezynfekcji prowadzonych w sieci wodociągowej, są to: ozonowanie, dezynfekcja chlorem, utlenianie, filtracja, temperatura, promieniowanie UV, dimeryzacja.

15. Na czym polega mechanizm utlenienia zredukowanych związków mineralnych?

Mechanizm utleniania zredukowanych związków mineralnych, jest wykorzystywany przez chemolitoautotrofy do przyswajania (asymilacji) CO2, z wykorzystaniem energii uwalnianej właśnie przy tym mechanizmie. Typ takiego odżywiania to chemosynteza; zdolność do chemosyntezy to cecha wyłącznie bakteryjna; proces ten jest często tlenowy i wymaga obecność w podłożu zredukowanych związków mineralnych takich jak np. : sole amonowe, azotyny, siarczki, tiosiarczany, siarka, sole żelazawe i wodór cząsteczkowy.

Oddychanie z redukcją związków mineralnych:
denitryfikacja- proces redukcji azotanów (NO3) przez bakterie glebowe i wodne (bez dostępu powietrza), podczas którego uwalnia się wolny azot (denitryfikacja całkowita) lub amoniak (denitryfikacja częściowa); denitryfikacja ma ogromne znaczenie w naturalnym czyszczeniu wód; bakterie nitryfikujące są organizmami anaerobowymi, żyjącymi w środowisku beztlenowym; występują w głębokich warstwach gleby na poziomie lustra wód gruntowych oraz w głębokich warstwach słabo mieszających się jezior;

desulfunikacja- redukcja siarczanów- procesy hydrogeochemiczne, zwykle biochemiczne zachodzące powszechnie w wodach podziemnych przejściu ze strefy utleniającej do redukującej; siarczany są redukowane do siarki lub siarkowodoru; procesy redukujące siarczany prowadzą często do przekształcenia chemizmu wód, np. wody syn sedymentacyjne morskich osadów dennych dzięki procesom redukującym siarczany, zachodzącym łącznie z wymianą jonową i wytrącaniem syngenetycznego kalcytu, przechodzą z typu wód SO4-Cl-Na w typ HCO3-Cl-Na+H2S;

redukcja węglanów- bakterie metanogenne, utleniają one wodór (H2) do H+, redukując CO2 do metanu; zysk energetyczny jest nieduży, wystarczający do wytworzenia 1 cząsteczki ATP na 1 cząsteczkę powstającego metanu; przenośnikiem elektronów jest pochodna flawinowa.

21. Transdukcja

Przeniesienie DNA z komórki dawcy do biorcy przez bakteriofaga nazywamy transdukcją. Zazwyczaj zostaje przeniesiony tylko mały fragment DNA gospodarza (tj. dawcy). Rozróżniamy dwa rodzaje trans-dukcji: niespecyficzną (ogólną), gdy każdy segment DNA gospodarza może zostać przeniesiony, i specyficzną, ograniczoną do przekazania określonych segmentów DNA. W transdukcji ogólnej fragment DNA gospodarza zostaje włączony do cząsteczki wirusa albo jako odcinek dodatkowy, albo zastępując genom fagowy. W transdukcji specyficznej tylko niektóre geny fagowe są zastąpione przez geny gospodarza. W obu przypadkach fagi transdukujące są zazwyczaj poronne, na przykład często tracą zdolność do lizy komórek gospodarza.

22. Budowa i funkcje ściany komórkowej.

Funkcje

  • Ogranicza wzrost komórki

  • Chroni przed urazami mechanicznymi

  • Chroni przed infekcjami bakteryjnymi i wirusowymi

  • Zabezpiecza przed nadmiernym parowaniem

  • Nadaje kształt i sztywność komórce

  • Chroni przed utratą wody

  • Przepuszcza substancje


Budowa

  • Składniki szkieletowe, stanowiące 40% całej jej masy :

eukariota:

rośliny - celuloza, która tworzy regularne łańcuchy celulozowe

grzyby - chityna

glony - koloza i mannoza (mieszanina wielocukrów amorficznych, lżejsza od celulozy)

prokariota:

sinice, bakterie - kwasy pileminowy, murawinowy, stanowiące razem mureinę.


  • Składniki podłoża, stanowiące 60% masy ściany komórkowej.

Wypełniają one wnętrze rusztowania utworzonego przez składniki szkieletowe. :

Białka pektyny hemicelulozy woda (do 60%)


23. Od czego zależy puchnięcie osadu.

W warunkach niekorzystnych (przeciążenie komory napowietrzania ładunkiem łatwo dostępnych substratów, wysoki deficyt tlenowy) dochodzi do przerostu utworów kłaczkowatych osadu i do tzw. pęcznienia osadu czynnego. Wyróżniamy pęcznienie włókniste i niewłókniste. Pęcznienie włókniste spowodowane jest nadmiernym rozwojem bakterii nitkowatych(Sphaerotilus natans, Beggiatoa alba lub Thiothrix nivea) lub grzybów. Natomiast przyczyną pęcznienia niewłóknistego jest rozwój bakterii wydzielających nadmierne ilości śluzów zewnątrzkomórkowych.

24. Bakterie nitryfikacyjne.

Nitryfikacja to proces biologicznego utleniania amoniaku do azotanów zachodzący przy udziale bakterii nitryfikacyjnych. Nitryfikacja to przekształcenie NH4+ i NO2- do NO3- prowadzone głównie przez chemolitotrofy. Uwolniona w tym procesie energia jest wykorzystywana do syntezy związków organicznych.

Nitryfikacja przebiega dwuetapowo:

● Najpierw amoniak jest utleniany do azotynu, bakterie utleniające NH4 do NO2 określane są przedrostkiem „nitroso-”. Należą tu m.in.: Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosocyjastis, Nitrosoglea. Są to bakterie właściwe, mają kształt drobnych pałeczek.

● Następnie powstały azotyn jest utleniany do azotanu, azotyny do azotanów utlenia grupa „nitro”: np. rodzaj Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus.

● Obie grupy bakterii nitryfikacyjnych są wrażliwe na zakwaszenie środowiska; zahamowanie ich wzrostu następuje przy pH 5.0.

Proces nitryfikacji może być prowadzony także przez mikroorganizmy heterotroficzne. Największą grupą mikroorganizmów przeprowadzających heterotroficzną nitryfikację są grzyby:Aspergillus flavus, Penicillium, Cephalosporium. Nitryfikacja prowadzona przez grzyby jest mniej wrażliwa na zakwaszenie i bardziej odporna na suszę. Wytworzone w glebie azotany mogą być przyswajane przez rośliny, wypłukiwane przez wodę lub rozkładane w procesie denitryfikacji.


26. Naturalne metody oczyszczania ścieków.

Wyróżnia się trzy zasadnicze metody oczyszczania ścieków : mechaniczne, chemiczne i biologiczne. W konkretnej oczyszczalni mogą być wykorzystane wszystkie wymienione sposoby lub niektóre z nich. W oczyszczalniach biologicznych zanim ścieki zostaną poddane działaniu mikroorganizmów, są wstępnie oczyszczane na drodze mechanicznej np. na kratach, w osadnikach czy piaskownikach. Istnieją cztery stopnie oczyszczania ścieków :

I stopień - oczyszczanie mechaniczne, polegające na usuwaniu zanieczyszczeń stałych, do zawiesin opadających włącznie,

II stopień - oczyszczanie biologiczne usuwające zanieczyszczenia rozpuszczone,

III stopień - usuwanie związków biogennych (głównie soli azotu i fosforu),

IV stopień - usuwanie resztkowych zanieczyszczeń trudno rozkładalnych, tzw. związków refrakcyjnych (ten stopień oczyszczania określany jest jako odnowa wody).

W procesie biologicznego oczyszczania ścieków zachodzą następujące zjawiska:

● rozkład substancji organicznych do CO2, H2O i NH3 (w zależności od pH),

● nitryfikacja (utlenianie NH3 za pomocą bakterii Nitrosomonas do azotynów),

a następnie za pomocą bakterii Nitrobacter do azotanów,

● denitryfikacja (przemiana azotanów do azotu gazowego N2).

Metody naturalne:

  • oczyszczanie w gruncie

  • pola nawadniane – ścieki wykorzystywane są do celów rolniczych, plon zwiększa się o ok. 20 %, roczna dawka – nie więcej niż 600 mm/ar.

  • Pola irygacyjne – różnica miedzy nimi a polami nawadnianymi polega na tym, że najważniejszym celem jest oczyszczenie ścieków a nie korzyści rolnicze. Dawka do 1500 mm/ar

  • \ Filtry gruntowe – do 3000 mm/ar, nie wykorzystuje się tych pól do celów rolniczych

Bakterie i substancje organiczne zatrzymują się na gruzełkach i oczyszczone ścieki filtrują niżej.


  • stawy ściekowe – zbiorniki ziemne (najczęściej zwykłe stawy). Stawy są dużo bardziej wrażliwe na obciążenie ściekami. Przy większych obciążeniach można stosować natlenianie. Najczęściej łączy się kilka stawów ze sobą:

  • bakteryjny

  • glonowy

  • skorupiakowy

  • oczyszczanie hydrobotaniczne (fitoremediacja)

  • w ekosystemach podmokłych, bagiennych

  • mikroorg. rozkładają materię organiczną

rośliny przyswajają produkty rozkładu i tworzą swoją biomasę (trzcina, pałka)

Dobór roślin – stosunkowo szybko rosnące, dające dużą biomasę, ma zdolność

akumulacji, mało podatna na działanie szkodników.

Od czego zależy takie oczyszczanie:

  • warunki meteorologiczne

  • stężenie zanieczyszczeń

  • pH, substancje biogenne

  • wiek plantacji

  • skład roślin zastosowanych

Zadania oczyszczania hydrobotanicznego:

  • rozkład substancji organicznej

  • usuwanie azotu

  • usuwanie fosforu

  • usuwanie pasożytów, bakterii, wirusów

(proc. sanitacji ścieków)

3 rodzaje oczyszczania hydrobotanicznego:

  • gruntowo – roślinne - ścieki spływają przez system korzeniowy

  • zbiorniki płytkie z roślinnością bagienną

  • zbiorniki z roślinnością pływającą po powierzchni


41. Rola bakterii w osadzie czynnym.

W oczyszczalni pracujących metodą osadu czynnego ścieki, po oczyszczeniu mechanicznym w osadniku wstępnym, są kierowane do komory osadu czynnego, zwanej też komorą napowietrzania, gdzie odbywa się właściwe oczyszczanie biologiczne. Kłaczki osadu wchodzą tu w kontakt ze ściekami w warunkach sztucznego napowietrzania i intensywnego mieszania. Bakterie obecne w kłaczkach pochłaniają substancję organiczną ze ścieków i część jej zużywają jako paliwo, część natomiast jako materię budulcową, co prowadzi do zwiększenia biomasy. Efektem tych procesów jest mineralizacja ścieków i wzrost masy osadu czynnego

44. Skład chemiczny komórek.

  • źródło węgla, które musi znajdować się w podłożu;

  • woda 70-86% suchej masy;

  • sucha masa :C:N:P 100:10:1

+ fosfor

+ węgiel

+ azot.

  • mikroelementy:

+ siarka

+ cynk

+ magnez

+ żelazo

+ mangan


45. Koniugacja bakterii.

Proces poziomego transferu genów u niektórych bakterii polegający na bezpośrednim przekazywaniu DNA z jednej komórki do drugiej, kiedy wchodzą one ze sobą w kontakt za pośrednictwem pilusów, czyli cieńkich mostków cytoplazmatycznych. Po wymianie materiału genetycznego organizmy rozłączają się i dzielą. Koniugacja najbardziej przypomina proces płciowy występujący u Eukaryota

50. Morfologia grzybów pleśniowych.

To grzyby tworzące grzybnię zbudowaną z luźno skupionych strzępek, tzw. grzybnię powietrzną

52. Ściana komórkowa bakterii gramujemnych.

U bakterii gramujemnych sieć mureiny jest jednowarstwowa i stanowi mniej niż 10% suchej masy ściany komórkowej (u Escherichia coli B). Mureina nie zawiera lizyny, lecz kwas m-diaminopimelinowy i nie występują w niej mostki międzypeptydowe. Budowa woreczków mureinowych, jak się wydaje, jest podobna u wszystkich zbadanych do tej pory bakterii gramujemnych. Oprócz części szkieletowej w skład ściany wchodzą duże ilości lipoprotein, lipopolisacharydów i innych lipidów, które są przyłą-czone do zewnętrznej powierzchni mureiny. Niektóre z nich są związane kowalencyjnie. Łącznie stanowią one 80% suchej masy ściany komór-kowej. Wydaje się, że do zachowania stabilności warstwy lipopolisacharydowej potrzebne są jony Ca2+. U wielu bakterii gramujemnych warstwa mureinowa staje się dostępna dla lizozymu, enzymu degradującego mureinę, dopiero gdy jony Ca2+ zostaną usunięte przez działanie EDTA. Ten czynnik chelatujący uwalnia część lipopolisacharydu. U bakterii gramujemnych nie wykryto kwasów tejchojowych.

56. Charakterystyka purpurowych bakterii siarkowych.

- grupa mikroorganizmów autotroficznych

- nazwa tej grupy pochodzi od zawartych w ich komórkach karotenoidów nadających im

kolor czerwony, purpurowy lub brązowy.

- donorem elektronów jest np. H2S utleniany do siarki gromadzonej wewnątrz komórek.

- wiążą one dwutlenek węgla w cyklu Calvina.

- występują w warstwie beztlenowej wód bogatych w siarczki np. Chromatium sp. , w ciemności mogą rosnąć w warunkach tlenowych w obecności związków organicznych.

60. Główne źródła bioaerozoli.

- rolnictwo i przemysł rolno-spożywczy

- oczyszczanie ścieków


Rolnictwo i przemysł rolno- spożywczy jest to najpoważniejsze źródło bioaerozolu, będące efektem intensyfikacji metod produkcji rolnej. Aerozol powstaje podczas wykonywania większości prac rolniczych, np. zbioru plonów

61. Rozpowszechnianie i przeżywalność mikroorganizmów.

Drobnoustroje po opuszczeniu swojego pierwotnego miejsca zasiedlania i przedostania się do powietrza, są nagle poddane działaniu licznych czynników niesprzyjających przeżyciu i część z nich ginie od razu, głównie z powodu wysuszenia. Te, które przeżyją stres nagłej zmiany warunków życia, są jednak nadal poddawane ich działaniu i z czasem zamierają.

Na przeżywalność wpływają następujące czynniki:

- odporność właściwa dla danego drobnoustroju,

- warunki meteorologiczne (m.in. wilgotność względna, temperatura, promieniowanie słoneczne),

- zanieczyszczenia powietrza,

- czas przebywania w powietrzu.

Obecne w powietrzu zanieczyszczenia, zwłaszcza węglowodory, ozon i tlenki azotu, aktywowane promieniowaniem słonecznym (głównie UV) tworzą różnorodne, silnie reaktywne zanieczyszczenia wtórne, określane jako utleniacze fotochemiczne m.in. PAN. Działają one toksycznie na wszelkie formy życia, również na mikroorganizmy zawieszone w powietrzu. Natomiast pyły czy mgły rozpraszają i absorbują promieniowanie słoneczne i zwiększają szanse przeżycia.

Promieniowanie słoneczne jest przyczyną:

- powstawania mutacji,

- powstawania wolnych rodników, które uszkadzają ważne makromolekuły,

- stwarzania zagrożenia wysuszeniem.

62. Plazmidy

Plazmid- cząsteczka DNA występująca w komórce poza chromosomem i zdolna do niezależnej replikacji. Występują u prokariotów, ale znane są także nieliczne plazmidy występujące u eukariotów. Zazwyczaj nie niosą genów metabolizmu podstawowego, a więc nie są komórce niezbędne do przeżycia. Mogą kodować produkty potrzebne w pewnych specyficznych warunkach, np. geny oporności na antybiotyki lub umożliwiające rozkład i asymilację różnych związków odżywczych. Plazmidy w drodze koniugacji mogą być przekazywane pomiędzy komórkami bakteryjnymi.

65. Bakterie chorobotwórcze przenoszone drogą wodną.

Do najbardziej typowych bakterii bezwzględnie chorobotwórczych pojawiających się

w zanieczyszczonych wodach powierzchniowych należą

  • pałeczki duru brzusznego, czyli pałeczki z gatunku Salmonella typhi,

  • inne Gram-ujemne bakterie z rodzaju Salmonella, które są przyczyną różnorodnych zakażeń przewodu pokarmowego, objawiających się wymiotami i biegunką.

  • Nieco rzadziej w zanieczyszczonych zbiornikach wodnych występują Gram-ujemne pałeczki z rodzaju, Shigella, które powodują czerwonkę bakteryjną.


W krajach tropikalnych, w wodach powierzchniowych często spotyka się bakterie z gatunku, Vibrio cholerae, czyli przecinkowce cholery.

Ponadto w wodach zanieczyszczonych spotyka się prątki gruźlicy Mycobacterium tuberculosis oraz krętki z rodzaju, Leptospira. Te ostatnie bakterie wywołują żółtaczkę bakteryjną.

Poza wymienionymi bakteriami bezwzględnie chorobotwórczymi w wodach powierzchniowych są liczne bakterie Gram-ujemne, które określa się mianem drobnoustrojów oportunistycznych, czyli warunkowo chorobotwórczych. Należą one do rodzajów Pseudomonas, Aeromonas, Klebsiella, Flavobacterium, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Acinetobacter, Proteus i Providencia. Wszystkie te pałeczki wchodzą w skład normalnej flory jelitowej i nie są w zasadzie chorobotwórcze, o ile bytują one w przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt. W pewnych przypadkach bakterie te przedostają się jednak z przewodu pokarmowego do innych narządów i wówczas mogą stać się przyczyną wielu chorób np. zapalenia układu moczowego, zapalenia dróg oddechowych, a także posocznicy, czyli uogólnionego zakażenia wszystkich narządów wewnętrznych.




MIKROBIOLOGIA laboratorium 4-5_Sterylizacja i dezynfekcja.doc

Podgląd pliku (pełna wersja wyższej jakości po zalogowaniu):
ĆWICZENIE 2

Temat 4-5: Sterylizacja i dezynfekcja



Literatura:


Kocwowa E.: Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej dla wyższych szkół technicznych. PWN 1984, Rozdział 5: „Sterylizacja (wyjaławianie) i jej metody” (str. 59 – 77)

Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien:

rozumieć różnicę między sterylizacją a dezynfekcją; znać podstawowe metody wyjaławiania oraz ich wady i zalety, ze szczególnym uwzględnieniem sterylizacji parą wodną pod ciśnieniem (autoklaw); znać podstawowe grupy chemicznych środków dezynfekcyjnych z podaniem ich krótkiej charakterystyki; wiedzieć, od jakich czynników i jak zależy działanie środków dezynfekcyjnych; wiedzieć, co to jest współczynnik fenolowy, jak się go określa i od czego zależy jego wartość; znać czynniki wpływające na działanie promieniowania UV; wiedzieć, jak można sprawdzić skuteczność sterylizacji; znać pojęcia: środek bakteriobójczy, środek bakteriostatyczny, współczynnik temperatury, forma wegetatywna, formy przetrwalne drobnoustrojów; umieć określić współczynnik fenolowy danego związku (substancji).


  1. Sterylizacja

Sterylizacja, czyli wyjaławianie, jest to niszczenie lub usuwanie wszystkich drobnoustrojów, zarówno ich form wegetatywnych (wykazujących aktywność życiową: odżywiających się, oddychających, rozmnażających się itp.) jak i przetrwalnych (endospory laseczek, zarodniki grzybów). Efekt taki można uzyskać poprzez zastosowanie czynników fizycznych, takich jak temperatura i promieniowanie oraz przez filtrację.


Sterylizacja parą wodną pod ciśnieniem

Metodą tą uzyskuje się najlepsze efekty jałowienia. Prowadzi ona do usunięcia form wegetatywnych i przetrwalnych wszystkich drobnoustrojów znajdujących się w sterylizowanych materiałach. Proces ten można przeprowadzać w szybkowarach i autoklawach. Najszersze zastosowanie ma autoklaw. Para wodna zasilająca to urządzenie może przechodzić z zewnętrznego źródła i wówczas przed wprowadzeniem do autoklawu wmontowany jest reduktor ciśnienia. Większość autoklawów posiada własne wytwornice pary wmontowane do aparatu. Autoklaw jest to dwuścienny kocioł z grubej blachy, zamykany szczelnie ciężką pokrywą. Zaopatrzony jest w manometr, termometr i zawór bezpieczeństwa. Zwykle wodę podgrzewa się za pomocą grzejnika elektrycznego. Wytworzona para wodna wypycha powietrze przez otwarty wypust. Następnie urządzenie zamyka się i para wytwarza w kotle ciśnienie wyższe od atmosferycznego. Dzięki temu podnosi się temperatura. Zwiększenie ciśnienia o 0,5 atmosfery powoduje ogrzanie pary wodnej do 111,70 C, a zwiększenie o 1 atmosferę do 121,60 C. W takich warunkach giną nawet formy przetrwalne drobnoustrojów. Najczęściej do sterylizacji podłoży bakteriologicznych stosuje się temperaturę 1210 C przez 20 minut. Nie jest to pełny cykl pracy urządzenia, bo należy także doliczyć czas usuwania powietrza, wprowadzania pary oraz czas schładzania, co razem zajmuje około 100 minut. Materiały, do których para wodna ma utrudniony dostęp wymagają zwiększenia ciśnienia pary wodnej lub wydłużenia czasu efektywnej pracy autoklawu.




Dekoktacja

Jest to wyjaławianie w gorącej parze bieżącej o temp. 1000 C. Proces ten prowadzi się w aparacie Kocha. Urządzenie to ma budowę kotła z pokrywą. Wyposażone jest w grzałkę do podgrzewania wody wypełniającej dno kotła. Nad wodą znajduje się metalowa siatka, na której ustawia się przedmioty i podłoża przeznaczone do jałowienia. Następnie kocioł nakrywa się. Para wydzielająca się podczas podgrzewania wody usuwa powietrze z kotła i przy ciśnieniu równym atmosferycznemu, przepływa przez aparat. Dekoktację prowadzi się przez 20 – 30 minut. W takich warunkach nie giną formy przetrwalne bakterii, zarodniki grzybów i wirusy zapalenia wątroby typu B. Metoda ta służy do wyjaławiania pożywek i przedmiotów termowrażliwych.


Tyndalizacja

Zabieg ten polega na trzykrotnym ogrzaniu materiałów w bieżącej parze wodnej przez 30 minut w odstępach 24 – godzinnych. W takich warunkach przy pierwszym ogrzaniu giną jedynie formy wegetatywne drobnoustrojów. W okresach 24 – godzinnych pomiędzy poszczególnymi ogrzewaniami, próby inkubuje się w termostacie w temp. pokojowej. Kiełkują wówczas formy przetrwane drobnoustrojów. Powstałe z nich formy wegetatywne ulegają zniszczeniu w czasie następnego ogrzania. Dla pewności, że wszystkie przetrwalniki miały szansę wykiełkowania, po następnej 24 godzinnej przerwie przeprowadza się trzecie ogrzanie próby.


Pasteryzacja

Proces ten pozwala na częściowe wyjałowienie materiału i polega na jednorazowym podgrzaniu płynu do temp. 620 C przez 30 min. W warunkach przemysłowych stosuje się temp. wyższe (70 – 900 C), krótszy czas pasteryzacji (sekundy) oraz szybkie schładzanie, w celu maksymalnego ograniczenia rozpadu składników odżywczych (witamin) zawartych w wyjaławianych produktach oraz uniknięcia zmian smaku i zapachu. Pasteryzuje się m.in. mleko, soki owocowe i warzywne, moszcz winny i piwo. Zabieg ten niszczy większość bakterii i innych drobnoustrojów (pierwotniaki, grzyby, glony, wirusy). Natomiast nie giną formy przetrwalne bakterii, zarodniki grzybów oraz wirusy zapalenia wątroby typu B. Tych ostatnich nie usuwa także gotowanie.


Gorące powietrze

Metoda ta służy do sterylizacji przedmiotów opornych na działanie wysokiej temperatury. Wyjaławianie przeprowadza się w zakresie temperatur od 140-1800 C. Służą do tego celu urządzenia zwane sterylizatorami lub suszarkami. Przedmioty poddawane sterylizacji muszą być opakowane w celu ich ochrony przed wtórnym zanieczyszczeniem mikrobiologicznym po zakończeniu sterylizacji. W praktyce najczęściej używa się do tego celu papieru lub specjalnych metalowych tubusów. Czas pracy suszarki zależy od zastosowanej temperatury, stopnia wypełnienia suszarki, czasu jej nagrzewania i oziębiania. W sterylizatorach wyposażonych w wentylatory przeciętny czas ekspozycji wsadu w temp. 1600 C wynosi 60 minut, a czas cyklu pracy ok. 150 minut, natomiast w temp 1800 C czas ekspozycji wynosi 30 min. W sterylizatorach starego typu, tzw. suszarkach, nie mających wymuszonego obiegu powietrza, czas sterylizacji jest dłuższy. W 1600 C czas ekspozycji wsadu wynosi 100 – 120 min. a pełny cykl pracy aparatu trwa kilka godzin.


Wyjaławianie przez spalanie i opalanie.

Spalanie służy do niszczenia materiałów i przedmiotów zakażonych drobnoustrojami chorobotwórczymi. Spala się np. plastikowe płytki Petriego z hodowlą zakaźnych mikroorganizmów zwłoki zwierząt doświadczalnych. Opalanie nad płomieniem palnika stosuje się jako jałowienie drobnych przedmiotów nie ulegających spaleniu, takich jak ezy, druciki platynowe, igły preparacyjne, łopatki, skalpele. Ponadto opala się zawsze brzegi kolb i probówek, w celu zabezpieczenia hodowli przed zakażeniem z zewnątrz.


Sterylizacja za pomocą radiacji

Do wyjaławiania stosuje się dwa typy promieniowania jonizującego: beta i gamma. Promieniowanie gamma charakteryzuje się dużą przenikliwością, natomiast promieniowanie beta jest promieniowaniem elektronowym o dużej energii. Skuteczna dawka promieniowania gamma waha się w zakresie 0,1 –1 megarada. Przy stosowaniu tego typu wyjaławiania należy zwrócić uwagę na właściwy dobór dawki. Zbyt mała dawka może spowodować, że wśród komórek bakterii, które przeżyły wyjaławianie, pojawią się mutanty o zmienionych właściwościach biologicznych. Niektóre z tych cech mogą okazać się niebezpieczne np. podwyższenie zjadliwości (zdolności wywoływania choroby). Praktycznie stosowana dawka sterylizująca jest duża i wynosi 2,5 – 3,0 megaradów. Należy także zwrócić uwagę na fakt, że promieniowanie jonizujące może powodować zmiany struktury związków chemicznych lub ich rozpad, co wiąże się ze zmianą cech chemicznych oraz odmiennym oddziaływaniem na drobnoustroje. Ponadto w wyniku napromieniowania związków organicznych powstają często nadtlenki, związki o podwójnych wiązaniach i wolne rodniki. Prowadzić to może do powstania produktów wykazujących działanie mutagenne i rakotwórcze.

Wyjaławianie przez filtrację

Proces ten polega na mechanicznym zatrzymaniu drobnoustrojów na filtrze. Działa on na zasadzie sita i w związku z tym średnica porów filtra musi być mniejsza od średnicy komórek oraz form przetrwalnych. Dodatkowo, część mikroorganizmów zatrzymywana jest przez siły adsorpcyjne na powierzchni filtra. Wyjaławianie tego typu stosowane jest do płynów, których składniki charakteryzują się dużą wrażliwością na działanie czynników fizycznych. Metoda ta pozwala na usunięcie nie tylko żywych komórek, form przetrwalnych, ale także komórek martwych oraz ich części.

Do najczęściej stosowanych filtrów należą: filtry z ziemi okrzemkowej, spiekanego szkła oraz filtry membranowe. Posiadają one zbyt małe pory, aby filtrację można było przeprowadzić z wykorzystaniem siły ciężkości. Konieczne jest więc zastosowanie nadciśnienia lub podciśnienia. Uzyskuje się je za pomocą pompy próżniowej.


Filtr z ziemi okrzemkowej

Znane są m. in. filtry Berkefelda. Zwykle są to świece otrzymane poprzez spiekanie w temp. 2000o C ziemi okrzemkowej. Charakteryzują się one dużą sprawnością działania. Skutecznie usuwają z filtrowanych roztworów formy wegetatywne i przetrwalne, jednakże nie zatrzymują wirusów. Wadą tych urządzeń jest też zbyt duża kruchość, wypłukiwanie ich cząstek do filtratu. Ponadto, część sączonego płynu pochłaniana jest przez filtr.

W mikrobiologii stosowane są filtry o najdrobniejszych porach, o symbolu W. Świece sterylizuje się w autoklawie. Podczas filtracji sączony płyn nalewa się tak, aby świeca była w nim całkowicie zanurzona.


Filtry ze szkła spiekanego

Najpopularniejsze w tej grupie są filtry Schotta. Powstają one poprzez stopienie w odpowiedniej temperaturze sproszkowanego szkła. Są to lejki z warstwą filtracyjną na dnie. Do wyjaławiania roztworów stosowane są tylko filtry nr 5, o najmniejszej średnicy porów. Filtry ze szkła spiekanego charakteryzują się dużą sprawnością działania oraz brakiem efektów ubocznych w postaci adsorpcji sączonych płynów, wymywania składników filtrów oraz zmiany pH przesączu. Ponadto mogą być one jałowione termicznie. Filtry tego typu zatrzymują wszystkie formy drobnoustrojów oprócz wirusów.


Filtry membranowe

Filtry (sączki) membranowe zbudowane są z pochodnych celulozy (np. z nitrocelulozy). Są to cienkie błony o grubości 80- 150 μm. Wielkość porów w filtrach jest zróżnicowana. Odpowiedni dobór sączka pozwala na całkowite usunięcie z roztworów drobnoustrojów. Filtry produkowane są w postaci krążków o różnych średnicach. Jałowi się je przez gotowanie w wodzie destylowanej. Następnie umieszcza w odpowiednich jałowych aparatach filtracyjnych. Sączenie odbywa się w podciśnieniu lub nadciśnieniu w zależności od konstrukcji aparatu. Sączony płyn nie ulega żadnym zmianom odczynu, nie jest adsorbowany przez filtr oraz do przesączu nie są uwalniane składniki filtra.

Filtry membranowe są stosowane nie tylko do sterylizacji płynów, ale także w badaniu stanu sanitarnego wody, gdzie celem nie jest oczyszczenie z mikroorganizmów, lecz wydzielenie ich z wody i dalsza hodowla na specjalnych pożywkach.

2. Dezynfekcja


Dezynfekcją nazywamy proces niszczenia wegetatywnych form drobnoustrojów za pomocą czynników chemicznych i fizycznych. Dezynfekcja nie niszczy wszystkich form przetrwanych. Celem dezynfekcji jest możliwie szybkie zabicie drobnoustrojów, ale głównym jej zadaniem jest wyeliminowanie mikroorganizmów chorobotwórczych z powierzchni sprzętów, podłóg, naczyń, pojemników z płynami, z części ciała ludzkiego (ręce, pole operacyjne), z ciała zwierząt.. A zatem dotyczy ona tych obiektów, które należy odkazić, nie mogąc poddać ich sterylizacji. Mechanizm działania środków dezynfekcyjnych jest tak różny jak różna jest budowa chemiczna dezynfektantów.

Środki dezynfekcyjne powodują bardzo istotne, nieodwracalne zmiany zarówno struktury jak i metabolizmu komórki bakteryjnej. Zmiany te mogą mieć charakter okresowego hamowania rozwoju drobnoustrojów, bądź ich całkowitego wyeliminowania. W związku z tym, środki dezynfekcyjne można podzielić na dwie grupy:

  1. środki bakteriostatyczne – mające właściwości hamowania rozmnażania bakterii (po ich usunięciu bakterie jednak ponownie zaczynają się rozmnażać);

  2. środki bakteriobójcze, posiadające właściwości zabijania bakterii, a więc ich działanie jest nieodwracalne.


Działanie dezynfektantów zależy od wielu czynników, do których należą :

  1. stężenie środka dezynfekcyjnego,

  2. czas działania,

  3. temperatura,

  4. obecność substancji organicznych w środowisku,

  5. wilgotność środowiska,

  6. odczyn środowiska,


Ad a) Na szybkość procesu dezynfekcji ma wpływ stężenie środka dezynfekcyjnego. Im stężenie jest wyższe, tym proces przebiega szybciej. Nie jest to jednak zależność proporcjonalna, np. podwojenie stężenia fenolu skraca czas wymagany do zabicia wszystkich osobników w hodowli Salmonella paratyphi w przybliżeniu siedmiokrotnie.

Ad b) W celu wyznaczenia zakresu działania środka dezynfekcyjnego oznacza się przeżywalność drobnoustrojów jako funkcję czasu działania badanego dezynfektanta w określonym stężeniu i przy określonej gęstości badanej hodowli.


Ad c) Wpływ temperatury na skuteczność procesu dezynfekcji wyraża się za pomocą tzw. współczynnika temperatury, według wzoru:


Czas wymierania w temp. x

Wsp. temp = -------------------------------------

Czas wymierania w temp. x + 10


Wartości współczynnika są tym wyższe im wyższa jest temperatura, w której przebiega proces.


Ad. d ) Charakter wpływu obecności związków organicznych może być chemiczny bądź fizyczny, przy czym mogą zachodzić różnego rodzaju reakcje:

1. Środek dezynfekcyjny reaguje ze związkami organicznymi, co powoduje jego unieczynnienie. W sytuacji, gdy związki organiczne są konkurencyjne w stosunku do drobnoustrojów, w reakcjach może dojść do całkowitego związania dezynfektanta i pozbawienia go skuteczności np. chlor stosowany do dezynfekcji wody jest wiązany przez zanieczyszczające ją związki organiczne tak, że efektywne stężenie dezynfektanta jest znacznie niższe od zastosowanego.

2. Środek dezynfekcyjny może dawać, w wyniku reakcji ze związkami organicznymi związek nierozpuszczalny, czego skutkiem jest jego wypadanie z roztworu i wyeliminowanie ze środowiska.

3. Eliminacja środka dezynfekcyjnego ze środowiska może być wynikiem jego adsorpcji przez mające postać zawiesiny lub koloidu substancje organiczne.

4. Tłuszcze, fosfolipidy, niektóre kationy i aniony mogą unieczynniać środek dezynfekcyjny poprzez jego eliminację ze środowiska

5. Związki organiczne mogą tworzyć wokół komórki bakteryjnej warstwę o mniejszej zawartości wody utrudniając dostęp środowiska dezynfekcyjnego do komórki.


Ad e) Duże znaczenie dla skuteczności dezynfekcji ma wilgotność środowiska, gdyż większość środków dezynfekcyjnych nie działa w środowisku suchym. Odpowiednia wilgotność umożliwia prawidłową kondensację czynnika dezynfekcyjnego na powierzchni komórek i wnikanie w głąb.


Ad f) Stężenie jonów wodorowych wpływa nie tylko bezpośrednio na organizm bakteryjny, lecz również na same środki odkażające, bowiem dla wielu substancji dezynfekcyjnych charakterystyczna jest mniejsza aktywność form zjonizowanych niż niezdysocjowanych, np. fenol w środowisku alkalicznym jest zdysocjowany, co poważnie obniża jego właściwości bakteriobójcze.

Istotnym problemem jest powstawanie drobnoustrojów opornych na środki dezynfekcyjne. Główną tego przyczyną jest stosowanie środków w stężeniach subtelnych. Przyczyną oporności może być adaptacja enzymatyczna. Enzymy indukcyjne biorące udział w rozkładzie środka dezynfekcyjnego powstają w komórce dopiero po zetknięciu się z odpowiednim związkiem lub jego analogiem. W okresie adaptacji wzrost bakterii ustaje, część bakterii zamiera, natomiast te, które przeżyły mają zdolność do enzymatycznego rozkładu (biodegradacji) dezynfektanta. Poddając dostatecznie dużą populację bakterii działaniu czynnika szkodliwego, jakim są środki dezynfekcyjne, wśród przeżywających komórek znajdujemy mutanty charakteryzujące się zwiększoną opornością na stosowany czynnik, w stosunku do komórki macierzystej.

Do najczęściej stosowanych chemicznych środków dezynfekcyjnych zaliczamy:

1) Kwasy i zasady – silne środki dezynfekcyjne – zabijają formy wegetatywne oraz formy przetrwalne. Stosowanie ich jest jednak ograniczone ze względu na niszczące działanie na przedmioty i materiały.

Zastosowanie znalazły :

  1. mleko wapienne w postaci 20% zawiesiny wodorotlenku wapnia,

  2. 10% roztwory zasad do dezynfekcji powierzchniowej,

  3. 1-10% gorące roztwory węglanu sodu do dezynfekcji szkła laboratoryjnego,

  4. mydła, zwłaszcza bardziej alkaliczne mydło szare, których skuteczność zwiększają nienasycone kwasy tłuszczowe,

2) Środki utleniające

Do grupy tej należą chlorowce i ich pochodne. Mechanizm ich działania polega na wydzielaniu zjonizowanego chlorowca lub tlenu po zetknięciu się z komórką.

Są to:

  1. podchloryny zawierające około 20% czynnego chloru,

  2. chloraminy nieorganiczne oraz organiczne jak np. chloramina T zawierająca 12, 5% czynnego chloru, chloramina T zawierająca 29,5% czynnego chloru. Są to związki dobrze rozpuszczalne w wodzie , mało wrażliwe na światło, trwałe w temp. pokojowej, których działanie bakteriobójcze jest najsilniejsze przy pH 6- 6,2. Do dezynfekcji

rąk np. stosuje się 0,6 – 1% roztwory chloramin. Do odkażania powierzchni podłóg i

stołów 5% roztwór. Do odkażania wody wystarczy 1mg/ dm3.

  1. odpowiednie roztwory nadmanganianu potasu,

  2. 3% woda utleniona,

  3. 10% roztwór jodu (jodyna) lub połączenia organiczne jodu. Związki tego typu niszczą wirusy, bakterie i pierwotniaki,

  4. ozon działający bakterio- i wirusobójczo, stosowany do dezynfekcji wody.


3) Sole metali ciężkich

Działają one zabójczo na drobnoustroje, zwłaszcza przy dłuższym czasie działania i przy zastosowaniu wyższych stężeń. W niższych stężeniach działanie niektórych metali ma charakter bakteriostatyczny. Ponieważ metale ciężkie są toksyczne dla organizmów wyższych, ich stosowanie jako dezynfektantów jest ograniczone. Pewne zastosowania znajdują związki organiczne rtęci jak merkurochrom, a także sole srebra.


4) Alkohole

Mechanizm ich działania polega na denaturacji białek komórkowych, przy czym wpływ ma tu obecność wody, dlatego lepiej działają 60- 70 % roztwory alkoholu niż 90%. Jako środek dezynfekcyjny używany jest:

  1. alkohol etylowy w stęż. 70% do odkażania skóry i w mieszaninie z innymi związkami do dezynfekcji narzędzi chirurgicznych,

  2. 70% mieszanina złożona w 50 % z etanolu i 20% propanolu,

  3. alkohol izopropylowy, benzylowy oraz glikol stosowane do dezynfekcji powietrza.



5) Związki fenolowe i pochodne fenolu

Fenole i ich pochodne mają działanie bakteriobójcze. Fenole niszczą bakterie, ale i grzyby. Największą aktywność dezynfekcyjną mają w środowisku kwaśnym. Fenol jest związkiem toksycznym i drażniącym, z tego względu nie jest obecnie stosowany do dezynfekcji. Zastosowanie znajduje natomiast szereg związków fenolu.

  1. mieszanina związków fenolowych i szarego mydła zwana lizolem stosowana w 3-10% roztworze

  2. alkilowe pochodne fenoli o działaniu dezynfekcyjnym, tym silniejszym im dłuższy jest łańcuch alkilowy

  3. izomery drugo- i trzeciorzędowe, chlorofenole oraz arylofenole

  4. cały szereg preparatów handlowych zawierających chloroheksydyny. Chloroheksydyna działa na bakterie gramdodatnie i gramujemne, drożdżaki i wirusy.


6) Czwartorzędowe związki amoniowe

Są to związki działające na wirusy, bakterie, drożdże i grzyby. Związki te charakteryzują się wysoką aktywnością powierzchniową. W wodzie ulegają dysocjacji na kompleksowe kationy i ujemnie naładowany jon chlorowca, który wzmaga aktywność bakteriobójcza. W użyciu znajduje się cały szereg preparatów zawierających różne stężenia związków amoniowych (np.Sterinol)


7) Aldehydy

W praktyce stosuje się aldehyd glutarowy i formaldehyd. Formaldehyd stosowany jest w 5% roztworze. Ma silne działanie bakteriobójcze pod warunkiem, że temperatura środowiska będzie niższa niż 400 C. Roztworem 40 % posługują się laboratoria i prosektoria. Materiały biologiczne utrwala się roztworem formaldehydu. Ponadto może on służyć do gazowej dezynfekcji pomieszczeń w stężeniu 1-2 mg/ dm3 powietrza. Dla skuteczności dezynfekcji powietrza formaldehydem konieczna jest duża wilgotność sięgająca 80%


Do fizycznych czynników dezynfekcji należy promieniowanie UV, które stosuje się głównie do dezynfekcji powietrza i dostępnych powierzchni. Silne działanie przeciwbakteryjne wykazuje promieniowanie o długości fali 240 - 280 nm (szczególnie 260 – 270 nm). Jednakże poszczególne gatunki i formy drobnoustrojów wykazują różną wrażliwość na działanie tego promieniowania. Metoda dezynfekcji powietrza promieniami nadfioletowymi jest skuteczna przy zachowaniu odpowiednich warunków i zależy od szeregu czynników:

  1. stopnia zanieczyszczenia powietrza cząstkami mechanicznymi,

  2. objętości napromieniowanego powietrza,

  3. intensywności ruchu powietrza,

  4. długości fal emitowanych przez promiennik,

  5. czasu napromieniowania,

  6. bezpośredniego padania promieniowania,

  7. wilgotności powietrza,

  8. odległości, na jaką działają promienie.

Stosując odpowiednią dawkę promieniowania UV można uzyskać nawet efekt całkowitego wyjałowienia (sterylizacji).








CZĘŚĆ PRAKTYCZNA

Zadanie 1. Mikrobiologiczna kontrola skuteczności sterylizacji parą wodną w autoklawie.


Oceny dokonuje się za pomocą specjalnych krążków nasyconych zawiesiną zarodników określonego szczepu laseczek z rodzaju Bacillus (tzw. sporali A). Zarodniki te zdolne są do przejścia w formę wegetatywną. Ponadto posiadają ściśle oznaczoną i powtarzalną charakterystykę przeżywania w warunkach sterylizacji parą wodną pod zwiększonym ciśnieniem.


1. Z opakowań wyjąć torebki papierowe z krążkami Sporal A i umieścić w różnych

miejscach komory autoklawu lub wewnątrz sterylizowanych materiałów.

2. Włączyć autoklaw (osoby posiadające uprawnienia do obsługi) i dokonać sterylizacji w

ciągu 20 minut w temperaturze nie mniejszej niż 1210 C.

3. Po zakończeniu sterylizacji przenieść krążki, z zachowaniem warunków jałowości, do

probówki z bulionem (użyć sterylnej pęsety).

4. Inkubować w odpowiedniej temperaturze przez 7 dni

5. W przypadku nieskutecznej sterylizacji w bulionie wystąpi zmętnienie, a na powierzchni

podłoża pojawi się kożuch z komórek bakterii. Jeżeli sterylizacja była skuteczna

bulion pozostanie klarowny.



Zadanie 2. Mikrobiologiczna kontrola skuteczności sterylizacji w suchym gorącym powietrzu.


Oceny dokonuje się za pomocą specjalnych krążków nasyconych zawiesiną zarodników określonego szczepu laseczek z rodzaju Bacillus (tzw. sporali S). Zarodniki te zdolne są do przejścia w formę wegetatywną. Ponadto posiadają ściśle oznaczoną i powtarzalną charakterystykę przeżywania w warunkach sterylizacji w suchym i gorącym powietrzu.


  1. Wyjąć z opakowania foliowego torebki papierowe z krążkami sporalu S

  2. Sterylizować co najmniej 2 godziny w temp. 160o C

  3. Po zakończeniu sterylizacji przenieść krążki, z zachowaniem warunków jałowości, do probówki z bulionem

  4. Inkubować w odpowiedniej temperaturze przez 7 dni

  5. W przypadku nieskutecznej sterylizacji, w bulionie wystąpi zmętnienie i pojawi się kożuch na powierzchni pożywki. Jeżeli sterylizacja była skuteczna, bulion pozostanie klarowny.



Zadanie 3. Zapoznanie się z podstawowym sprzętem służącym do sterylizacji


a. autoklaw

b. suszarka





Zadanie 4. Badanie skuteczności działania wybranych środków dezynfekcyjnych


  1. Podzielić pisakiem do szkła denko szalki Petriego z agarem odżywczym na 5 sektorów i opisać je następująco: K, -OH, H2O2, NaCl, M, co oznacza odpowiednio: kontrolę – palec nie dezynfekowany, dezynfekcję alkoholem, wodą utlenioną, przetarcie roztworem soli fizjologicznej i mycie mydłem. Na wieczku szalki napisać swoje inicjały, datę i godzinę.

  2. Uchylić wieczko szalki i delikatnie przyłożyć opuszkę jednego z palców do powierzchni agaru w sektorze kontrolnym K. Szybko zamknąć szalkę.

  3. Sterylną pęsetą pobrać sterylną watę, namoczyć ją w alkoholu uważając, aby nie była zbyt nasiąknięta, a następnie przetrzeć nią opuszkę innego palca.

  4. Przetarty palec przyłożyć do sektora –OH jak w pkt. 2. Zużytą watę wyrzucić.

  5. W podobny sposób przetrzeć palce: wodą utlenioną i roztworem soli, oraz wykonać odciski w odpowiednich sektorach (za każdym razem użyć inny palec).

  6. Wymyć ręce mydłem i wytrzeć ręcznikiem, a następnie nieużywany dotąd palec przyłożyć do sektora M.

  7. Szalkę inkubować w temp. pokojowej przez tydzień.


Po okresie inkubacji porównać wzrost w poszczególnych sektorach, uwzględniając liczbę kolonii i ich zróżnicowanie morfologiczne, a nie powierzchnię wzrostu (dlaczego?). O czym świadczą stwierdzone różnice? Czy mycie mydłem radykalnie usunęło drobnoustroje z powierzchni palca? Jeśli nie, to jakie znaczenie higieniczne ma mycie rąk ?



Zadanie 5. Oznaczenie współczynnika fenolowego


Współczynnik fenolowy pozwala na określenie siły działania środka dezynfekcyjnego w

porównaniu do bakteriobójczego działania fenolu w tych samych warunkach.

  1. Wykonać rozcieńczenia fenolu i rozlać po 5 ml do sterylnych probówek. Równolegle ustawić taką samą ilość opisanych probówek z podłożem bulionowym.

  2. Przygotować rozcieńczenia wybranych środków dezynfekcyjnych i rozlać po 5ml do sterylnych probówek Równolegle ustawić taką samą ilość opisanych probówek z podłożem bulionowym

  3. W odstępach co 30 sek. zaszczepiać kolejne rozcieńczenia fenolu inoculum (E. coli) o objętości 0,5 ml i wymieszać na wstrząsarce.

  4. Po 15 minutach inkubacji (czas kontaktu ze związkiem) przenosić ezą co 30 sek. materiał z zaszczepionych rozcieńczeń do probówek z bulionem odżywczym.

  5. Postąpić analogicznie jak w pkt. 3 i 4 z wybranymi związkami dezynfekcyjnymi

  6. Wszystkie zaszczepione podłoża bulionowe inkubować 48 godzin w 37o C.

  7. Wyniki zestawić w tabeli określając wzrost obserwowany jako zmętnienie bulionu znakiem „+ „ i brak wzrostu znakiem „ –

  8. Wyznaczyć współczynnik fenolowy ( WF )


Największe rozcieńczenie badanego związku zabijające bakterie

WF = ------------------------------------------------------------------------------

Największe rozcieńczenie fenolu zabijające bakterie



Zadanie 6. Badanie skuteczności działania promieniowania ultrafioletowego na drobnoustroje

obecne w powietrzu

Badanie obecności bakterii i grzybów w powietrzu przed włączeniem lampy UV:


  1. Położyć dwie szalki Petriego z agarem odżywczym i dwie z podłożem Sabourauda w

pobliżu wyłączonej lampy UV i zdjąć wieczka na 10 minut.

  1. Po 10 min. nałożyć wieczka i usunąć szalki, a na ich miejsce położyć nowe.

Badanie obecności bakterii i grzybów w powietrzu po włączeniu lampy UV:


  1. Włączyć lampę UV na przynajmniej 30 minut.


Uwaga: nie przebywać w strefie działania promieni UV !


  1. Po 30 minutach wyłączyć lampę i otworzyć szalki Petriego na 10 minut.

  2. Po 10 minutach zamknąć szalki.

  3. Opisać użyte szalki Petriego odpowiednio: „przed UV” i „po UV” i wszystkie inkubować w temp. pokojowej przez tydzień.


Po okresie inkubacji policz wszystkie kolonie wyrosłe na płytkach z agarem odżywczym i podłożem Sabourauda przed i po działaniu promieniowania UV. Postaraj się odróżnić kolonie bakteryjne (zwykle wypukłe i kolorowe, lub płaskie i matowe) od grzybowych (zwykle nitkowate, „watowate”).

Oceń skuteczność działania promieniowania UV i wyjaśnij, od jakich czynników ona zależy. Które drobnoustroje są bardziej wrażliwe: bakterie czy grzyby ?


Zadanie 7. Badanie skuteczności filtracji


1. Pobrać 1 cm3 wody przeznaczonej do sterylizacji i wprowadzić ją (posiać) do probówki z

bulionem odżywczym (probówkę opisać: przed filtracją)

1. Sterylną pęsetą wyciągnąć filtr membranowy ze zlewki z wodą i umieścić go na sitku w

obudowie filtra

2. Zamontować górną część obudowy filtra

3. Podłączyć filtr do pompki wodnej

4. Wlać wodę przeznaczoną do sterylizacji i odkręcić kurek kranu w celu wywołania

podciśnienia

5. Po przefiltrowaniu wody odkręcić obudowę filtra, zdjąć sitko z filtrem i pobrać sterylnie

pipetą 1 cm3 filtratu, po czym posiać go do drugiej probówki z bulionem odżywczym

(probówkę opisać: po filtracji)

6. Obie probówki z posianym bulionem inkubować przez tydzień w temperaturze

pokojowej.

Po okresie inkubacji porównać wzrost w obu pożywkach i ocenić skuteczność filtracji.

MIKROBIOLOGIA laboratorium 9-10_Analiza mikrobiologiczna GLEBY.doc

Podgląd pliku (pełna wersja wyższej jakości po zalogowaniu):
Badania mikrobiologiczne gleby dla celów sanitarnych

Temat 9: Analiza mikrobiologiczna gleby



Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien:

  • Wiedzieć, co to jest gleba i co rozumiemy pod pojęciem edafonu glebowego,

  • Znać, jakie mikroorganizmy występują w glebie i czym się charakteryzują,

  • Umieć scharakteryzować mikroorganizmy glebowe i omówić ich rolę w glebie,

  • Znać rolę flory i fauny glebowej,

  • Umieć scharakteryzować mikroflorę autochtoniczną i zymogeniczną gleby.

  • Znać pojęcia: edafon, rizosfera, patogen, fitoedafon, zooedafon, helminty oraz pozostałe wymienione w punkcie 5.3.

  • Znać zakres sanitarnej analizy mikrobiologicznej gleby

  • Umieć oznaczyć liczebność w glebie bakterii, grzybów oraz jaj robaków pasożytniczych.



1.Gleba - to powierzchniowa warstwa litosfery ziemskiej, utworzona z wietrzejącej skały, przekształconej w specyficzny sposób przez organizmy żywe. Gleba jest złożonym utworem umożliwiającym funkcjonowanie ekosystemów glebowych. W skład gleby wchodzą cząstki stałe mineralne i organiczne, powietrze i roztwór glebowy oraz bytujące w niej organizmy żywe - edafon. Proporcje poszczególnych składników w glebie utrzymują się mniej więcej na tym samym poziomie właściwym dla danej gleby.

2. Edafon glebowy

  • Organizmy zasiedlające glebę tworzą złożony zespół o bardzo dużej liczebności zwany edafonem. Są to mikroorganizmy, grzyby, jednokomórkowce roślinne i zwierzęce, rośliny naczyniowe oraz bezkręgowce bytujące w przypowierzchniowej warstwie gleby.

  • Edafon może stanowić od 1 do 10% suchej masy substancji organicznej gleby.


Ze względu na rozmiar organizmy żyjące w glebie można zaliczyć do trzech grup:

- Mikrobiota (niedostrzegalne gołym okiem)- wirusy, bakterie, grzyby, pierwotniaki, glony

- Mezobiota (0,2-2 mm) - wazonkowce, nicienie, ślimaki, owady bezskrzydłe, wije, roztocza i inne, małe rośliny,

- Makrobiota (>2 mm) - dżdżownice, krety, gryzonie np. myszy polne, większe owady, korzenie dużych roślin i drzew.

3. Charakterystyka mikroorganizmów glebowych.


Wirusy

  • Wirusy prowadzą wyłącznie pasożytniczy tryb życia – reprodukują się w komórkach bakterii, roślin, zwierząt i człowieka.

  • W środowisku glebowym najważniejszą rolę odgrywają wirusy bakterii – bakteriofagi,

  • Fagi są jednym z elementów nisz ekologicznych ograniczającym nadmierny rozwój bakterii,

  • Rola fagów w środowisku glebowym polega na ich zdolności niszczenia niektórych populacji bakterii i w związku z tym - prowadzenia ich selekcji, zarówno negatywnej, jak i pozytywnej. Przykładem negatywnego ich działania są fagi atakujące bakterie brodawkowe z rodzaju Rhizobium będące przyczyna spadku plonów roślin motylkowych


Bakterie


  • Bakterie stanowią podstawową masę mikroorganizmów glebowych. Charakteryzują się one wysoką aktywnością metaboliczną.

  • Większość bakterii glebowych odznacza się właściwością przylegania (adhezji) do powierzchni cząstek mineralnych i koloidów glebowych.

  • Szczególnie duże ilości bakterii gromadzą się w pobliżu resztek tkanek roślinnych i zwierzęcych oraz w odchodach zwierząt dostających się do gleby. Środowiskiem specjalnie sprzyjającym rozwojowi bakterii są korzenie roślin i ich inne podziemne części.

  • Bakterie glebowe można podzielić na dwie grupy: takie, które występują w glebie zawsze, niezależnie od jej rodzaju i żyzności (autochtoniczne) oraz takie, które rozwijają się w niej masowo po wprowadzeniu do gleby dużej ilości materii organicznej (zymogeniczne).

  • Wśród licznych bakterii glebowych ilościowo dominują promieniowce oraz maczugowce z rodzaju Arthrobacter

Grzyby

  • Grzyby należą do organizmów eukariotycznych. Są bezwzględnymi chemoorganotrofami, większość z nich to tlenowce lub grzyby fermentacyjne. Energię i węgiel do budowy własnych komórek czerpią z rozkładu substancji organicznej. Nie posiadają chlorofilu. W przeciwieństwie do bakterii, ściana komórkowa grzybów zawiera chitynę, glukan i inne polisacharydy.

  • Bytują one zwykle w powierzchniowych warstwach gleby; można je także spotkać na głębokości do ok. 1 m.

  • Wchodzą w symbiotyczne zależności z glonami, owadami, i roślinami wyższymi. Wiele gatunków grzybów jest patogennych dla człowieka, roślin i zwierząt.

  • Ich formy wegetatywne tworzą nitkowate strzępki, mniej lub bardziej rozgałęzione, zwykle wielokomórkowe, których gęste sploty formują grzybnię lub plechę. Poszczególne komórki mają wielkość ok. 10 m.

  • Do najpospolitszych grzybów glebowych należą rodzaje:Penicillium, Aspergillus, Trichoderma, Verticillium, Fusarium, Rhizopus, Mucor, Zygorhynchus, Chaetomium.

  • Grzyby rozwijają się silnie w glebach kwaśnych i wpływają istotnie na zmiany odczynu gleby.

Rola bakterii i grzybów
  • Są współtwórcami struktury gleby – tworzą próchnicę - najważniejszy koloid glebowy, wpływający w zasadniczy sposób na jej strukturę, właściwości sorpcyjne, zasobność w składniki organiczne.

  • Wpływają w decydujący sposób na powstawanie gruzełkowatej, gąbczastej struktury gleby przez wytwarzanie śluzów otoczkowych oraz, w przypadku bakterii nitkowatych i grzybów, przez formę swego wzrostu.

Flora glebowa (fitoedafon)

Fitoedafon stanowią głównie glony, oraz w mniejszym stopniu rośliny wyższe.

Glony stanowią główny składnik fitoedafonu. Najliczniej występują na powierzchni gleby; do głębszych warstw dostają się na skutek jej uprawy, przesiąkania wody, działalności zwierząt i zdolności migracji. Wyróżniamy zbiorowiska glonów żyjących na powierzchni gleby – epifitoedafon oraz w głębszych jej warstwach - endofitoedafon

Fauna glebowa

Mikrofauna glebowa reprezentowana jest przez pierwotniaki (Protozoa). Odżywiają się one głównie bakteriami, ich rola polega na selekcji i odmładzaniu populacji bakterii glebowych. Dominują wśród nich korzenionóżki (ameby) i wiciowce. Mezofaunę reprezentują nicienie, wazonkowce, ślimaki, owady, wije, roztocza i inne. Odżywiają się one martwą materią organiczną przyczyniając się do tworzenia próchnicy. Spośród makrofauny pewne znaczenie mają dżdżownice, krety, gryzonie, które rozdrabniają materiał glebowy i przenoszą go na znaczną głębokość. Najważniejszą rolę wśród bezkręgowców odgrywają w glebie dżdżownice, które odżywiają się martwą materią organiczną, pobierając ją wraz z mineralną częścią gleby. Niestrawione resztki zmieszane z glebą mineralną i metabolitami wydalają w postaci grudek (koprolitów), przyczyniając się w ten sposób do tworzenia korzystnej gruzełkowatej struktury gleby i do jej spulchniania. W ciągu roku dżdżownice mogą na hektarze przepuszczać przez swój przewód pokarmowy około 7 tys. kg gleby. Dzięki ruchliwości zwierząt gleba ulega ciągłemu mechanicznemu mieszaniu, co powoduje lepsze jej napowietrzenie, natlenienie i przepływ wody.



4. Podział mikroflory glebowej ze względu na pochodzenie


Mikroflora autochtoniczna

Mikroflorę gleby dzieli się na autochtoniczną i zymogeniczną. Drobnoustroje autochtoniczne czerpią energię z rozkładu materii organicznej powodując jej mineralizację. Przedstawicielami tej grupy w glebie są najczęściej drobnoustroje, dla których źródło węgla i energii stanowią substancje humusowe, tj. związki powstałe z rozkładu i przetworzenia materii organicznej pochodzenia roślinnego i zwierzęcego. Przedstawicielami tej grupy są najczęściej tlenowe nieprzetrwalnikujące bakterie z rodzaju Arthrobacter oraz prątki z rodzaju Mycobacterium. Stałymi mieszkańcami gleby są także promieniowce z rodzaju Streptomyces i Nocardia oraz bakterie śluzowe (Myxobacteriales). Dla gleby, choć nie tylko dla niej, charakterystyczne są bakterie wiążące azot atmosferyczny, bakterie nitryfikacyjne. Pospolite są także tlenowe laseczki przetrwalnikujące z rodzaju Bacillus i beztlenowe z rodzaju Clostridium.


Mikroflora zymogeniczna

Drobnoustroje zymogeniczne wprowadzane są do gleb okresowo. Pochodzą one z wprowadzanych do gleb ścieków, odpadów komunalnych i przemysłowych oraz z odpadów powstających w hodowli zwierząt (np.obornik i gnojówka), Są to organizmy o dużych wymaganiach odżywczych, których rozwój uzależniony jest od dopływu świeżej, łatwo przyswajalnej materii organicznej. Bakterie zymogeniczne bytujące w glebie to głównie gramujemne pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae oraz z rodzaju Pseudomonas, Achromobacter, Flavobacterium.

W glebie zanieczyszczonej odchodami czy szczątkami zwierząt i roślin mogą występować drobnoustroje chorobotwórcze (patogenne). Spośród bakterii szczególnie niebezpieczne dla człowieka są pałeczki duru brzusznego z rodzaju Salmonella i pałeczki czerwonki – Shigella., beztlenowe laseczki wywołujące tężec – Clostridium tetani, zgorzel gazową – Clostridium perfringens, zatrucia pokarmowe – Clostridium botulinum oraz tlenowe laseczki wąglika – Bacillus anthracis, a także prątki – Mycobacterium tuberculosis.

Ponadto do bakterii chorobotwórczych występujących w glebie zalicza się niektóre promieniowce wywołujące tzw. promienicę. Grzyby są przyczyną zakażeń skóry i tkanek wewnętrznych, a organizmy zwierzęce jak pierwotniaki i robaki – chorób głównie przewodu pokarmowego. Szczególną uwagę należy zwrócić na możliwość występowania w glebie jaj robaków pasożytniczych np. glisty ludzkiej. Jej jaja przechodzą w glebie okres dojrzewania i wykazują dużą odporność na działanie czynników zewnętrznych. Podobnie jak endospory bakterii, zarodniki grzybów i cysty pierwotniaków, mogą przez długi okres czasu bytować w glebie i stanowić zagrożenie dla człowieka.


5. Ocena jakości gleby za pomocą analizy mikrobiologiczno-helmintologicznej.


5.1. Analizę stosuje się do oceny:

  • metod unieszkodliwiania odpadków miejskich,

  • jakości osadów ściekowych, odpadów i nawozów wykorzystywanych do celów rolniczych,

  • stanu sanitarnego gleby przy planowaniu i budowie osiedli mieszkaniowych , żłobków przedszkoli, obiektów dla służby zdrowia i przemysłu spożywczego oraz rekreacyjnych, jak również do oceny stanu sanitarnego gleby na cele rolnicze.

Ponadto uzyskane wyniki mogą być przydatne do wyjaśnienia dróg zakażenia i określenia czasu przeżywalności mikroorganizmów chorobotwórczych w glebie. Są one również istotne z punktu widzenia możliwości zakażenia poprzez glebę wód gruntowych i powierzchniowych.


5.2. Zakres analizy mikrobiologicznej gleby pod względem sanitarnym powinien obejmować:


  • Oznaczenie obecności w glebie bakterii chorobotwórczych z rodzaju Salmonella. W glebie przeznaczonej do celów rolniczych nie mogą się znajdować bakterie należących do tego rodzaju.


  • Badania helmintologiczne polegające na określeniu liczby żywych jaj robaków jelitowych: glisty ludzkiej (Ascaris lumbricoides), glisty psiej (Toxocara sp.), włosogłówki (Trichuris trichiura), określeniu stadium ich rozwoju oraz stopnia odporności na różne warunki mikroklimatyczne.


Stopień zanieczyszczenia gleby jajami robaków (helmintów) określa się w odniesieniu do 100 g gleby, uznając glebę za:

    • nie zanieczyszczoną - nie wykrycie jaj,

    • słabo zanieczyszczoną - wykrycie pojedynczych jaj (1-3),

    • średnio zanieczyszczoną - wykrycie do 10 jaj,

    • silnie zanieczyszczoną - wykrycie 10 jaj i więcej


Ponadto badania uzupełnić można o oznaczenia:

  • ogólnej liczby bakterii – wykonywane na podłożu agarowym, temperatura - 280C, czas inkubacji –48 h,

  • bakterii przetrwalnikujących (sporowych) – podłoże agarowe, temperatura 280C, czas inkubacji–48 h,

  • bakterii termofilnych – podłoże agarowe, temperatura 550C, czas inkubacji–24 h.

  • liczebności bakterii wskaźnikowych:

  • pałeczek grupy coli,

  • pałeczek grupy coli typu fekalnego (termotolerancyjnych), głównie pałeczki okrężnicy (Escherichia coli),

  • laseczek Clostridium perfringens,


5.3. Określenia stosowane w analizie mikrobiologiczno-helmintologicznej gleby:

  • Miano – najmniejsza ilość badanej gleby wyrażona w gramach, w której stwierdza się jeszcze obecność badanych bakterii.

  • Bakterie grupy coli – Gram-ujemne pałeczki niewytwarzające przetrwalników, rozwijające się w warunkach względnie beztlenowych, mające zdolność fermentowania laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu w ciągu 48 h hodowania w temperaturze 35-37OC. Należą one do rodzaju Escherichia, Citrobacter i Enterobacter w obrębie rodziny Enterobacteriaceae.

  • Bakterie coli typu fekalnego (termotolerancyjne) pałeczki okrężnicy (Escherichia coli) – są to pałeczki z grupy coli, które poza wszystkimi właściwościami tej grupy (pałeczki Gram-ujemne, oksydazoujemne, niewytwarzające przetrwalników, względnie beztlenowe, fermentujące laktozę z wytworzeniem kwasu i gazu w temperaturze 370C w ciągu 48 h oraz dające charakterystyczne kolonie na pożywce Endo) mają ponadto zdolność wzrostu oraz przeprowadzania niektórych procesów biochemicznych, a w szczególności fermentowania laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu również w temperaturze 440C

  • Bakterie Clostridium perfringens – są to nieruchliwe, beztlenowe laseczki Gram-dodatnie wytwarzające otoczki i wykazujące zdolność do fermentacji glukozy, laktozy, rozkładu żelatyny, a także redukcji siarczynów do H2S.

  • Bakterie z rodzaju Salmonella chorobotwórcze pałeczki przewodu pokarmowego. Wiele gatunków bakterii tego samego rodzaju wywołuje salmonellozy, czyli zatrucia pokarmowe. Salmonella typhi wywołuje chorobę zwaną durem brzusznym.

  • Bakterie wytwarzające przetrwalniki (bakterie sporowe) – Gram-dodatnie laseczki (tlenowe i beztlenowe) wytwarzające przetrwalniki (zwane również endosporami). Należą głównie do rodzaju Bacillus i Clostridium.

  • Bakterie termofilne – to bakterie rozwijające się w wyższych temperaturach, 45-600C (optimum – 550C), głównie w oborniku i kompoście, stosowanych do nawożenia i mogą być wskaźnikiem ich obecności w glebach uprawnych.

  • Ogólna” liczba bakterii – to wskaźnik zawartości związków organicznych w glebie.

  • W końcowym etapie procesu mineralizacji, w miarę wyczerpywania się łatwo rozkładalnych źródeł pokarmowych wzrasta ilość spor bakteryjnych Stosunek ogólnej liczby bakterii do liczby bakterii sporowych – świadczy o stopniu rozkładu w glebie związków organicznych.

  • Badania helmintologiczne – służą wykrywaniu robaków jelitowych w glebie, a głównie ich jaj (tzw. jaj „geohelmintów”):

  • glisty ludzkiej (Ascaris lumbricoides),

  • glisty psiej (Toxocara sp.),

  • włosogłówki (Trichuris trichiura).

  • Stadium tworzenia się larwy w jaju i okresy zdolności życiowych robaków (helmintów) w glebie, mogą być użyte do oceny, od jak dawna gleba jest zanieczyszczona.




CZĘŚĆ PRAKTYCZNA


Analiza mikrobiologiczno-helmintologiczna gleby



Pobieranie próbek do badań:

  1. Przy wyborze miejsca pobrania próbek gleby konieczne jest posiadanie danych charakteryzujących:

  • strukturę gleby,

  • sposoby nawożenia,

  • pokrycie roślinne,

  • warunki klimatyczne,

  • należy uwzględnić również:

  • wielkość badanej powierzchni gleby,

  • umiejscowienie na niej źródeł zanieczyszczenia,

  • obecność lub brak kanalizacji.

  1. Słoje zawierające próbki gleby należy zamknąć korkami z waty i zaopatrzyć w etykiety uwzględniające:

  • datę i miejsce pobrania próbki,

  • nazwisko pobierającego.


Przechowywanie i przesyłanie próbek:

Badanie bakteriologiczne gleby należy wykonać w dniu pobierania próbek. W razie konieczności ich przechowywania oraz podczas transportu do laboratorium należy umieścić je w temperaturze ok. 40C na okres nie dłuższy niż 24 h.


Przygotowanie próbki do badań:

  • Objętość posiewanej próbki uzależniona jest od jej rodzaju i stopnia zanieczyszczenia oraz celu badania i wymagań sanitarnych.

  • Przygotowane rozcieńczenia próbek mogą być przetrzymywane nie dłużej niż 30 min.


Przed posiewem należy:

  • Sprawdzić probówki z pożywką Kesslera i odrzucić te, w których stwierdza się obecność pęcherzyka powietrza w probówce Durhama.

  • Wszystkie naczynia z pożywkami należy odpowiednio oznakować podając:

  • numer próbki,

  • datę

  • i ewentualnie posiewaną objętość próbki.

  • Przy posiewie próbki, jak i przy jej rozcieńczeniu, należy zachować warunki jałowości.


Zadanie 1. Badanie „ogólnej” liczby bakterii saprofitycznych, przetrwalnikujących

oraz termofilnych

Badanie przeprowadza się metodą płytkową Kocha stosując posiew wgłębny próbek

na podłoże agarowe odżywcze. Badania obejmują określenie:

  1. „ogólnej” liczby bakterii na podłożu agarowym odżywczym – zwykłym, w temperaturze - 280C w czasie inkubacji – 48±2 h,

  2. liczby bakterii termofilnych – na podłożu agarowym odżywczym – 3 %, w temperaturze 550C, czas inkubacji–24±2 h.

  3. liczby bakterii wytwarzających przetrwalniki (sporowych) – na podłożu agarowym odżywczym – zwykłym, w temperaturze 280C, czas inkubacji–48±2 h,

  • w celu usunięcia niesporowej flory bakteryjnej, rozcieńczenia gleby przed posiewem należy ogrzewać na łaźni wodnej w ciągu 15 minut w temperaturze 800C.

  • Do posiewu należy użyć po 1 cm3 zawiesiny z następujących rozcieńczeń:

  • gleba piaszczysta – 10-1 –10-3,

  • gleba ogrodowa oraz kompost z odpadków miejskich: 10-4 – 10-6.

  • Po okresie inkubacji należy policzyć ilość wyrosłych kolonii. Do obliczenia liczby kolonii wybrać płytki, na których wyrosło 30-300 kolonii.

  • Równolegle oznaczyć suchą masę 100 g próbki gleby uprzednio wysuszonej w temperaturze 1050C do uzyskania stałej wagi.

  • Ostateczny wynik badania podaje się jako liczbę bakterii występującą w 1 g sm gleby w stosunku do „ogólnej” liczby bakterii. Należy też podać procentową zawartość bakterii sporowych..


Zadanie 2. Wykrywanie bakterii grupy coli i bakterii coli typu kałowego (Escherichia

coli)

Bakterie wykrywa się metodą fermentacyjną probówkową, opartą na zdolności tych

bakterii do fermentowania laktozy z wytworzeniem w podłożu kwasu oraz widocznego

gazu.

  1. Oznaczenia bakterii grupy coli przeprowadza się w 3 etapach:

    • Etap I - Badanie wstępne - polega na posiewie (wprowadzeniu) odpowiednich objętości roztworu glebowego do podłoża płynnego Kesslera-Swenartona i inkubacji w temperaturze 37 OC przez 24-48 h.

Za wynik dodatni badania wstępnego przyjmuje się:

  • obecność każdej objętości gazu w probówce Durhama, lub wystąpienie pęcherzyków gazu w całej objętości pożywki przy lekkim wstrząśnięciu, przy jednoczesnym zmętnieniu podłoża i jego zakwaszeniu (zmiana barwy z granatowej na żółtą o różnym stopniu intensywności).

  • Powyższe zmiany mogą wystąpić po pierwszej lub drugiej dobie hodowli.

  • Wyniki należy odczytywać po raz pierwszy bezwzględnie po 18-24 h.

  • Przy braku uprzednio podanych zmian po 24 h hodowle inkubuje się dalej i ponownie odczytuje wynik po 48 h.

Za wynik ujemny badania wstępnego przyjmuje się:

  • brak gazu i zakwaszenia po 48 h inkubacji.

Za wynik wątpliwy badania wstępnego przyjmuje się:

  • pojawienie się bardzo małej ilości gazu przy jednoczesnym bardzo słabym zakwaszeniu lub braku zakwaszenia, szczególnie po 48 h.

  • Hodowle uznane za wątpliwe po 24 h inkubacji poddaje się badaniu potwierdzającemu już po tym okresie, a następnie inkubuje dalej do 48h.

  • W przypadku uzyskania wyniku dodatniego badania potwierdzającego z dwudziestogodzinnej hodowli, nie wykonuje się badania potwierdzającego po raz drugi po 48 h.

    • Etap II – Badanie potwierdzające – należy wykonać w celu potwierdzenia obecności bakterii grupy coli, w zasadzie ze wszystkich dodatnich i wątpliwych hodowli badania wstępnego uzyskanych po 24 lub 48 h. Potwierdzenie hodowli dodatnich uzasadnia się koniecznością wykluczenia tzw. wyników dodatnich fałszywych. Badania potwierdzające obecność bakterii grupy coli wykonuje się na pożywce Endo metodą posiewu powierzchniowego.

Badanie potwierdzające wykonuje się zgodnie z metodyka stosowaną w badaniu mikrobiologicznym wody dla celów sanitarnych.

    • Etap III Badanie uzupełniające – jest to dalszy etap badania potwierdzającego i stosuje się je w przypadku, gdy na pożywce Endo wyrosną nietypowe bakterie, podejrzewane o przynależność do bakterii grupy coli.

Badanie uzupełniające wykonuje się zgodnie z metodyka stosowaną w badaniu mikrobiologicznym wody dla celów sanitarnych.

  • W zależności od rodzaju próbki stosuje się następujący system posiewów:

    • gleba piaszczysta – 10 cm3 z rozcieńczenia 10-1, czyli 10 x 0,1 g – co jest równoważne 1 g gleby,

    • gleba ogrodowa i kompost z odpadków miejskich:

        • 10 cm3 z rozcieńczenia 10-1, czyli 10 x 0,1 g – co jest równoważne 1 g gleby,

        • 1 cm3 z rozcieńczenia 10-1-10 -6, czyli 1 x 0,1 – 0,000001 g.

Posiewy 10 cm3 próbki rozcieńczonej 10-1 należy wykonać na podłoże o stężeniu podwójnym, a posiewy 1 cm3 próbek z rozcieńczeń 10-1 – 10-6 na podłoże o stężeniu normalnym.

  • Ostateczny wynik badania podaje się jako miano bakterii grupy coli (miano coli).


  1. Oznaczenia bakterii coli typu kałowego (termotolerancyjnych), pałeczki okrężnicy (Escherichia coli) - przeprowadza się w 2 etapach:

    • Etap I - Badanie wstępne - polega na posiewie (wprowadzeniu) odpowiednich objętości roztworu glebowego do podłoża płynnego Kesslera-Swenartona i inkubacji w temperaturze 37 OC przez 24-48 h (tak jak w etapie I przy oznaczaniu bakterii grupy coli). Badanie wstępne wykonuje się zgodnie z metodyka stosowaną w badaniu mikrobiologicznym wody dla celów sanitarnych.

    • Etap II – Badanie potwierdzające – ma na celu stwierdzenie, czy bakterie fermentujące laktozę w badaniu wstępnym należą do grupy coli typu kałowego. Badanie potwierdzające wykonuje się zgodnie z metodyką stosowaną w badaniu mikrobiologicznym wody dla celów sanitarnych.

    • W przypadku konieczności lub potrzeby zidentyfikowania bakterii jako Escherichia coli, należy wykonać dodatkowo badania:

  • według szeregu IMViC,

  • lub zastosować szybki test w temperaturze 44 0C.

Identyfikowanie bakterii jako Escherichia coli, wykonuje się zgodnie z metodyką stosowaną w badaniu mikrobiologicznym wody dla celów sanitarnych.

  • Ostateczny wynik badania podaje się jako miano bakterii coli typu kałowego (miano E. coli).


Zadanie 3. Wykrywanie bakterii Clostridium perfringens

Przeprowadza się je stosując posiew wgłębny próbek na podłoże siarczynowo-żelazowe

wg. Wilsona-Blaira w temperaturze 370C przez 18-24±2 h. (Wykrywanie bakterii

Clostridium perfringens można przeprowadzać również metodą hodowli na pożywce

stałej).

  • Do posiewu należy użyć po 1 cm3 zawiesiny z następujących rozcieńczeń:

  • gleba piaszczysta – 10-1 –10-4,

  • gleba ogrodowa oraz kompost z odpadków miejskich: 10-1 – 10-6.

  • W celu wyeliminowania mikroflory niesporowej wszystkie rozcieńczenia próbek należy przed posiewem ogrzewać w łaźni wodnej w temperaturze 800C w ciągu 15 min.

  • Pojawienie się w ciągu pierwszych 18 h inkubacji w głębi agaru czarnych kolonii często rozrywających podłoże na skutek wytwarzania gazu świadczy o obecności Clostridium perfringens. Czarne zabarwienie kolonii powstaje w wyniku redukcji siarczynu do siarczku sodu, który z chlorkiem żelaza tworzy czarno zabarwiony siarczek żelaza.

  • Ostateczny wynik badania podaje się jako miano bakterii Clostridium perfringens.


Zadanie 4. Oznaczanie bakterii z rodzaju Salmonella

Badanie przeprowadza się w 2 etapach:

  • Etap I – Badanie wstępne – metoda hodowli na podłożu płynnym wybiórczo -namnażającym z kwaśnym seleninem sodu, w którym pewne pałeczki chorobotwórcze ulegają namnożeniu, a wzrost innych jest w różnym stopniu zahamowany - polega na posiewie (wprowadzeniu) odpowiedniej ilości gleby do podłoża namnażającego i inkubacji w temperaturze 370C przez 18-24 h.

Za wynik dodatni badania wstępnego przyjmuje się:

    • zmętnienie podłoża,

    • uzyskanie barwy ceglastej.

Za wynik ujemny badania wstępnego przyjmuje się :

    • brak zmętnienia i barwy podłoża.

Za wynik wątpliwy badania wstępnego przyjmuje się:

    • pojawienie się bardzo słabego zmętnienia przy jednoczesnym słabym zabarwieniu podłoża na kolor ceglasty,

    • brak zmętnienia i zabarwienie na kolor ceglasty.

    • Hodowle uznane za wątpliwe po 18-24 h inkubacji poddaje się badaniu potwierdzającemu.

    • Etap II Badanie potwierdzające – należy wykonać w celu potwierdzenia obecności bakterii z rodzaju Salmonella, w zasadzie ze wszystkich dodatnich i wątpliwych hodowli badania wstępnego uzyskanych w czasie 18- 24 h. Potwierdzenie hodowli dodatnich uzasadnia się koniecznością wykluczenia tzw. wyników dodatnich fałszywych. Badania potwierdzające obecność bakterii z rodzaju Salmonella wykonuje się w temperaturze 370C, na podłożach wybiórczo-różnicujących, stałych, na których w zależności od właściwości biochemicznych kolonie drobnoustrojów mogą wykazywać różnice o znaczeniu rozpoznawczym. Z tego rodzaju podłoży zalecane są podłoża wykorzystujące zdolność pałeczek jelitowych do fermentacji laktozy, co uwidacznia się jako zmiana zabarwienia kolonii lub jako zdolność do zmiany potencjału oksydoredukcyjnego w czasie wzrostu drobnoustrojów:

    • metodą powierzchniową:

      • na podłożu Mc Conkeya,

      • na podłożu SS (Salmonella-Shigella).

    • metodą kłutą i posiewu powierzchniowego na podłożu Kliglera

Za wynik dodatni badania potwierdzającego przyjmuje się:

      • na podłożu Mc Conkeya – obecność i wzrost kolonii nie rozkładających laktozy, czyli kolonii o zabarwieniu różowym,

      • na podłożu SS (Salmonella-Shigella) - obecność i wzrost kolonii bezbarwnych, gładkich z czarnymi środkami,

      • na podłożu Kliglera:

- zmianę barwy dolnej części podłoża na żółtą, podczas gdy

powierzchnia skośna pozostaje bez zmian (czyli ma kolor czerwony

tak jak pożywka wyjściowa),

- ciemnienie (zaczernienie) podłoża wskazujące na wytworzenie się

siarkowodoru z równoczesnym rozmieszczaniem się tego gazu

wewnątrz podłoża w postaci baniek.

  • W wykrywaniu bakterii z rodzaju Salmonella wykorzystywane są również podłoża pozwalające na wykrycie właściwości biochemicznych izolowanych drobnoustrojów np.: fermentacji cukrów, alkoholi, wytwarzanie indolu itp

  • Do posiewu należy użyć 4 x 25 g gleby, tak, aby zostało przebadane 100 g gleby.


Zadanie 5. Wykrywanie żywych jaj robaków jelitowych i określenie stadium ich

rozwoju:

  • glisty ludzkiej (Ascaris lumbricoides),

  • glisty psiej (Toxocara sp.),

  • włosogłówki (Trichuris trichiura).

Wykrywanie żywych jaj pasożytów jelitowych wykonuje się w 3 etapach:

  • Etap I – polega na „odlepieniu” jaj pasożytów od podłoża (grudek ziemi i osadów). Etap ten trwa 1 h i przeprowadzony jest z użyciem 5 % wodorotlenku sodu.

  • Etap II

      • flotacja- przeprowadzona przy użyciu 5 % siarczanu cynku i w wyniku wirowania roztworu glebowego (od 1 do 5 wirowań).

      • zagęszczanie do niewielkiej ilości, za pomocą pipety, wyflotowanych na powierzchnię roztworu glebowego jaj pasożytów.

  • Etap III – to obserwacja i rozpoznawanie jaj pasożytów przy użyciu mikroskopu.

mikro 011.jpg

Plik dostępny po zalogowaniu.

mikro 014.jpg

Plik dostępny po zalogowaniu.

mikrobiologia cz.1.doc

Podgląd pliku (pełna wersja wyższej jakości po zalogowaniu):

MIKROBIOLOGIA-ZAGADNIENIA cz. I


  1. Wielkość i kształt komórek bakteryjnych

Są jednymi z najmniejszych mikroorganizmów.

  • Najmniejsze z nich (tzw. ciałka elementarne form L bakterii mają rozmiar ok. 0,15-1,2 μm;

  • Największe ( bakterie purpurowe i siarkowe) osiągają rozmiar kilkunastu mikrometrów.

Drobne wymiary stwarzają konieczność uproszczenia w budowie wewnętrznej i mniej doskonałego rozdziału funkcji pomiędzy organelle komórkowe.

Kształt komórek bakteryjnych:

  • bakterie właściwe (Eubacteriae)

  • kuliste:

  • ziarniaki (Coccus)

  • dwoinki (Diplococcus)

  • paciorkowce (Streptococcus)

  • gronkowce (Staphylococcus)

  • pakietowce (Sarcina)

  • czworaczki (Tetracoccus)

  • cylindryczne:

  • pałeczki

  • laseczki (Bacillus) (wydłużone i ucięte na końcach)

  • maczugowce (Corynebacterium)

  • przecinkowce (Vibrio)

  • śrubowce (Spirillum)

  • krętki

  • skręcone: (ten typ morfologiczny był uwzględniony w instrukcji, prof. Kołwzan podawała tylko te 2 w/w.)

  • przecinkowce (Vibrio)

  • śrubowce (Spirillum)

  • krętki

Kształt i wielkość komórek bakteryjnych są w znacznym stopniu zależne od:

  • wieku i warunku hodowli;

  • temperatury inkubacji;

  • czasu trwania hodowli;

  • rodzaju podłoża

  • składu chemicznego podłoża odżywczego;

  • zmiany w obrębie materiału genetycznego.

Na podłożu standardowym i w stałych warunkach hodowli komórki danego gatunku mają określony kształt będący ich istotna cecha diagnostyczną. W okresie starzenia się bakterii mogą powstawać formy o zmiennych kształtach ( powstaje na skutek zaburzenia w mechanizmie wytworzenia błon podziałowych, nagromadzeniu się w środowisku metabolitów, niekorzystnych warunków rozwoju dla komórek np. natlenienie, temperatura pH środowiska itp.


  1. Omówić budowę i funkcję form przetrwanych.

  • Budowa przetrwalnika:

  • rdzeń – cytoplazma otoczona błoną komórkową, czyli protoplast przetrwalnika zawiera wszystkie struktury potrzebne do syntezy białek oraz wytwarzania energii na drodze glikolizy;

  • ściana przetrwalnika – warstwa znajdująca się najbliżej na zewnątrz błony cytoplazmatycznej. Jest zbudowana z mureiny, po wykiełkowaniu endospory w komórkę wegetatywną staje się ścianą komórkową;

  • korteks – najgrubsza warstwa ochrony przetrwalnika, zbudowana z mureiny, o mniejszej liczbie mostków poprzecznych niż ściana komórkowa. Zawiera kwas dipikolinowy, wrażliwa na działanie lizozymu;

  • płaszcz – wewnętrzny i zewnętrzny zbudowany jest z białka kreatyno podobnego z wieloma mostkami dwusiarczkowymi. Jest nieprzepuszczalny zawiera dużą odporność na antybiotyki i środki dezynfekujące. Osłony te mogą stanowić do 50% objętości i 40-60% suchej masy;

  • egzosporgium – występuje tylko u niektórych gatunków Bacillus błona lipoproteinowa, zawierająca niektóre węglowodany;

  • Przetrwalniki zawierają o około 40% więcej białka i prawie 4-krotnie mniej węglowodanów niż komórki wegetatywne. Charakterystycznym dla endospor związkiem (występującym tylko w nich) jest kwas dipikolinowy Kwas ten wiąże jony wapnia w stosunku 1:1 tworząc dipikolinianwapnia, ( mogący stanowić do 15% suchej masy spory). Związek ten odgrywa znaczną rolę w ciepłooporności endospor. Przetrwalniki nie zawierają β-hydroksymaślanu, który w komórkach wegetatywnych stanowi prawie 30% suchej masy.

  • Funkcja:

  • Są to formy rozwoju umożliwiające przetrwanie warunków, które mogłyby być zabójcze dla normalnych postaci wegetatywnych. Zdolność do wytwarzania endospor (przetrwalników) ma tylko nieliczna grupa bakterii, są to względne i bezwzględne tlenowce z rodzaju Bacillus, Sporosarcina oraz bezwzględne beztlenowce z rodzaju Clostridium;

  • wysoka temperatura – bakterie giną po 10-minutowym ogrzewaniu w 80°C, natomiast endospory wytrzymują nawet wielogodzinne gotowanie i mogą kiełkować kiedy trafia na korzystne warunki środowiska (ciepłooporność jest proporcjonalna do zawartości kwasu dipikolinowego);

  • niska temperatura – odporna nawet na zamrażanie, głównie dzięki grubym ścianom i minimalnej zawartości wody;

  • promieniowanie – dzięki dużej liczbie mostków siarczkowych w zewnętrznych osłonkach białkowych;

  • wysuszenie – mogą przetrwać latami, a nawet wiekami bez wody;

  • czynniki chemiczne (wysokie i niskie pH, duże stężenie NaCl).

  • nie służą rozmnażaniu, a jedynie przetrwaniu, gdyż każda komórka może wytworzyć w swym wnętrzu jedynie jeden przetrwalnik.

Rodzaje przetrwalników:

  • Endospory – (powstające wewnątrz komórki macierzystej) charakteryzują się największą odpornością na ciepło, wysychanie, promieniowanie i czynniki chemiczne spośród wszystkich form przetrwanych;

  • Cysty – ( Azotobacter, Methylocystis) okrągłe, grubościenne komórki, są odporne na wysychanie, mechaniczne naprężenie, promieniowanie. Różnica między nimi, a endosporami polega na tym, że;

  • są to przekształcone całe komórki wegetatywne, a nie ich części;

  • nie są odporne na ciepło.

  • Mikrocysty – występują u bakterii śluzowych, twory kuliste lub w kształcie krótkich pałeczek, są oporne na wysuszenie względnie oporne na podwyższona temp. i odznaczające się zdolnością przetrwania niekorzystnych warunków.

  • Konidia (promieniowce) – często wytworzone na specjalnych nitkach sporonośnych, maja tendencje do wyrastania ku górze ponad podłoże, nie są tak wytrzymałe na temperaturę jak endospory, ale dość dobrze znoszą suszę.


  1. Narządy ruchu mikroorganizmów i ich budowa:

U większości bakterii aktywny ruch wywołany jest rotacja rzęsek. Możliwy jest także ruch ślizgowy (bakterie śluzowe)

Rzęski - są to wyrostki o średnicy 12-18 nm i długości do 20 μm. Składają się z 3 części: włókna, ciałka podstawowego (ciałka bazalnego) i haka łączącego obie te części. Są zaczepione jednym końcem w wewnętrznej osłonie komórki – błonie cytoplazmatycznej i łączą się z jej treścią protoplazmatyczną. Mają kształt lekko skręconej spirali o równej grubości na całej długości i składają się z heliakalnie zwiniętych łańcuchów kurczliwego białka zwanego flagelliną. Umiejscowienie i liczba rzęsek jest dla bakterii cechą charakterystyczną i ma znaczenie taksonomiczne. Rzęska działa jak śruba napędowa a jej ruchy mogą odbywać się zgodnie lub niezgodnie ze wskazówkami zegara.

Organellum ruchu niektórych krętków jest włókno osiowe, składa się ono z pęczka włókienek. Swą budową przypomina typowe rzęski prokariotyczne, wyrastają one z bieguna komórki i spiralnie ja oplatają, dzięki takiej lokalizacji możliwy jest wężykowaty ruch bakterii w środowisku o dużej lepkości.


  1. Fimbrie i pili (koniugacja)

Charakterystyczne struktury występujące wyłącznie u bakterii to fimbrie - zakotwiczone w cytoplazmie nitkowate wyrostki. Są to struktury podobne do rzęsek bakteryjnych, przy czym są one znacznie mniejsze, sztywniejsze i delikatniejsze. Osiągają średnicę 3-25 nm, długość do 12 μm. Zbudowane są z białka zwanego piliną, syntezowanego w cytoplazmie w postaci prebiałka. Cienkie fimbrie ułatwiają przyczepianie się komórek do podłoża oraz między sobą(wytwarzanie nalotu).

Grubsze wyrostki, zwane też pilami płciowymi (pilami typu F),służą podczas koniugacji do przenoszenia DNA (pilusy – organ za pomocą którego, komórki męskie rozpoznają komórki żeńskie i łączą się w procesie koniugacji). Są to puste rurki białkowe o długości do 10 μm.

Koniugacja – przenoszenie dziedzicznych cech dawcy na szczep biorcy przez bezpośredni kontakt w parach. Połączenie się 2 bakterii zachodzi poprzez mostek cytoplazmatyczny utworzony przez pili płciowe. Koniugują tylko bakterie F+ (dawca, zawiera czynnik płciowy F i może wytwarzać pili płciowe) z bakterią F- (biorca, nie ma czynnika F). Podczas koniugacji biorca może uzyskać czynnik F i zacznie wytwarzać pili płciowe, stanie się dawcą.


  1. Otoczki i śluzy międzykomórkowe

Są to mniej lub bardziej grube warstwy substancji zawierającej dużą ilość wody.

  • Otoczki - mogą być polisacharydowe (głównie z glukozy lub dekstranu), polipeptydowe(gł. z kwasu poliglutaminowego) oraz mieszane cukrowo-lipidowe lub białkowo-cukrowe. Otoczki można uwidocznić pod mikroskopem świetlnym stosując barwniki nie przechodzące przez materiał otoczkowy, np. nigrozynę, czerwień Kongo, tusz chiński. W technice barwienia negatywnego na ciemnym tle preparatu pojawiają się jasne otoczki. Cieńsze otoczki barwi się z wykorzystaniem swoistych przeciwciał.

  • Otoczki chronią bakterie przed wyschnięciem;

  • ułatwiają adhezję;

  • chronią przed reakcją obronną zakażanego organizmu.

Wykazano też, że niektóre bakterie syntetyzujące otoczki są bardziej oporne na działanie antybiotyków, gdyż ich przenikanie do komórki jest utrudnione. U bakterii chorobotwórczych otoczki mogą być czynnikiem zjadliwości, tzn. bakterie otoczkowe są bardziej zjadliwe.

  • Śluzy otoczkowe – są to liczne substancji otoczkowe wydzielane do środowiska, można je oddzielić od powierzchni komórek przez wstrząsanie. Jest wynikiem gromadzenia się na powierzchni komórek polimerów, polisacharydów i polipeptydów.

  • ułatwiają bakteriom przetrwanie okresu suszy;

  • chronią przed szkodliwymi czynnikami zewnętrznymi;

  • chronią bakterie przed fagocytozą (pochłonięcie i strawienie przez komórki żerne krwi i tkanek).


  1. Ściana komórkowa bakterii gram + i gram -, różnice

  • Ściana komórkowa jest elastyczną strukturą nadającą komórce określony kształt;

  • stanowi barierę ochronną przed czynnikami zewnętrznymi fizycznymi i chemicznymi, a także przed innymi mikroorganizmami;

  • jest przepuszczalna dla licznych substancji i soli mineralnych;

  • szkielet ściany składa się z polimeru –peptydoglikanu, zwanego mureiną.

Ściana komórkowa bakterii gram dodatnich

  • Mureina stanowi 30-70% suchej masy ściany komórkowej, składa się z około 40 warstw.

  • Do murein przyłączone są też różne kwasy tejchojowe (łańcuchy złożone z 8-50 cząsteczek glicerolu lub rybitolu połączonych mostkami fosfoestrowymi).

Ściana komórkowa bakterii gram ujemnych

  • Sieć mureiny jest jednowarstwowa i stanowi mniej niż 10% suchej masy ściany komórkowej.

  • W ścianie bakterii gramujemnych nie wykryto kwasów tejchojowych.

  • Część dominującą ściany stanowi warstwa plastyczna, którą tworzy błona zewnętrzna zbudowana z fosfolipidów, białek, lipoproteidu Brauna, lipopolisacharydu/LPS/.

  • Białka o funkcji transportowej (poryny) tworzą w błonie kanały wypełnione wodą, które pozwalają na wniknięcie do komórki niskocząsteczkowych substancji hydrofilowych.

  • Między błoną zewnętrzną a mureiną znajduje się tzw. przestrzeń peryplazmatyczna. Zawiera ona znaczną ilość enzymów biorących udział m.in. w rozkładzie substratów(metanol, glukoza),wykorzystywaniu związków nieorganicznych(siarczany, azotany),rozkładzie białek, polisacharydów, kwasów nukleinowych.

  • Lipopolisacharydy (LPS) mają duże znaczenie w diagnostyce bakteriologicznej i epidemiologii. Różne szczepy Salmonella typ himurium oraz Shigella desynteriae odpowiedzialne za infekcje jelitowe różnicuje się dzięki O-swoistem ubocznemu łańcuchowi lipopolisacharydów występujących w ich błonie zewnętrznej. Różnice wykrywa się metodami immunologicznymi i serologicznymi, które pozwalają na identyfikacje szczepu i zlokalizowanie źródła infekcji.

RÓŻNICE

GRAM +

GRAM -

gruby peptydoglikan

cienki peptydoglikan

kwasy tejchojowe:

przepływ jonów, ochrona, specyficzność antygenowa

brak kwasów tejchojowych

wrażliwe na lizozym

odporne na działanie lizozymu

są wrażliwe na penycilynę

mało wrażliwe na penycilinę

bardzo wrażliwe na detergenty

mało wrażliwe na detergenty

duża wrażliwość na barwniki anilinowe

mała wrażliwość na barwniki anilinowe

wrażliwe na eozynę i błękit metylowy

wrażliwe na safraninę

mała zawartość poliamin

duża zawartość poliamin

duża zapas wolnych aminokwasów

mały zapas wolnych aminokwasów

Barwienie metoda Grama – jest to barwienie złożone, pozytywne, w którym stosuje się kolejne dwa kontrastowe barwniki zasadowe: fiolet krystaliczny i fuksynę. Właściwy proce poprzedzony jest termicznym utrwaleniem preparatu. Bakterie gramdodatnie barwią się na fioletowo, gramujemne na czerwono


  1. Budowa i funkcja rybosomów

Rybosomy są drobnymi tworami zbudowanymi z dwóch podjednostek

  • małej 30S, zawiera 16S rRNA oraz od 1 do 21 specyficznych białek

  • dużej 50S, zawiera 23S rRNA oraz od i do 32 specyficznych białek

U Prokaryota są mniejsze niż u Eukaryota, mają niższą masę cząsteczkową i stałą sedymentacji Svedberga (która określa sedymentacje w ultrawirówce), wynoszącą70S, w porównaniu do 80S u Eukaryota. Różnice między rybosomami mają ogromne znaczenie przy leczeniu infekcji, gdyż niektóre antybiotyki wybiórczo hamują syntezę białek na rybosomach 70S, nie wpływając na działanie rybosomów 80S.

Podjednostki rybosomów występują w cytoplazmie oddzielnie, łączą się ze sobą tylko po połączeniu z mRNA w czasie syntezy białek. Tworzą wtedy polirybosomy (polisomy) –skupienia wielu rybosomów połączonych nicią mRNA. Są centrami syntezy białek i jako takie odgrywają zasadnicza role w przemianie materii.

Biosynteza białka, zachodzący w żywych komórkach organizmu proces powstawania białka uwarunkowany przez zapisaną w DNA (kwasy nukleinowe) informację genetyczną (gen).
Pierwszym jego etapem jest
transkrypcja odpowiedniego odcinka DNA, która polega na syntezie RNA na matrycy określonego odcinka DNA przy udziale polimerazy RNA. RNA powstały w wyniku transkrypcji, zawierający informacje dla syntezy białek, zwany jest mRNA. Przenosi on transkrybowaną informację genetyczną z jądra do cytoplazmy. Tutaj dochodzi do modyfikacji mRNA, tzn. do wycinania, z udziałem odpowiednich enzymów, sekwencji niekodujących - intronów i pozostawiania sekwencji kodujących - egzonów. Tak zmodyfikowane i skrócone cząsteczki mRNA wnikają pomiędzy dwie podjednostki rybosomów, gdzie odbywa się właściwe odczytywanie kodu genetycznego i przepisywanie go na sekwencję aminokwasową białka w procesie zwanym translacją.
Znajdujące się w cytoplazmie aminokwasy są przenoszone na rybosomy za pomocą tRNA. Cząsteczki tRNA z doczepionymi aminokwasami przedostają się do rybosomów i kolejno dopasowują się, na zasadzie komplementarności, swoimi
antykodonami do odpowiednich kodonów mRNA. Translacja zaczyna się od kodonu startowego, zapewniającego dalsze odczytywanie mRNA we właściwej kolejności - najczęściej jest to kodon AUG lub GUG, a kończy się kodonem symbolizującym ostatni aminokwas (u prokariontów są to kodony nonsensowne - nie oznaczające żadnego aminokwasu). Po zakończeniu syntezy cząsteczki białka wędrują przez przestrzenie pomiędzy błonami reticulum endoplazmatycznego do aparatu Golgiego albo wydzielane są na zewnątrz komórki, lub pozostają przez jakiś czas związane z błonami ziarnistego (szorstkiego) reticulum endoplazmatycznego i wykorzystywane jako białka wewnątrzkomórkowe. Energia potrzebna do syntezowania wiązań peptydowych pochodzi z wysokoenergetycznych wiązań ATP.
Biosynteza białka może zachodzić również w
mitochondriach i plastydach roślinnych, w których występuje DNA.


  1. Budowa i funkcja błony cytoplazmatycznej

  • Wykazuje typową dla wszystkich błon elementarnych strukturę trójwarstwową i zbudowana jest z lipidów (20-35%) i białek (50-75%).

  • Składa się z podwójnej warstwy lipidowej. Hydrofobowe końce fosfolipidów i trój glicerydów skierowane są do środka, a hydrofilowe „główki” na zewnątrz.

  • W tę podwójną warstwę włączone są białka, niektóre przenikają przez całą grubość błony, inne tylko przez część(białka integralne) lub są przyłączone do zewnętrznej i wewnętrznej warstwy hydrofilowej(białka powierzchniowe).

Funkcje błony komórkowej:

jako półprzepuszczalna stanowi barierę osmotyczną komórki i kontroluje wnikanie i usuwanie różnych substancji,

jest miejscem zakotwiczenia enzymów biorących udział w przenoszeniu elektronów i w fosforylacji oksydatywnej, a więc w tworzeniu i magazynowaniu energii,

uczestniczy w procesach syntezy ściany komórkowej, składników otoczki śluzowej, pili, fimbrii, a także wydziela enzymy zewnątrzkomórkowe,

stanowi centrum replikacji DNA.

Rodzaje transportu:

DYFUZJA BIERNA - najprostszy sposób przenikania, ponieważ substancje przenikają wg. gradientu stężeń tzn. z obszaru o wyższym stężeniu do obszaru o niższym stężeniu.

TRANSPORT AKTYWNY - cząsteczki przechodzą do komórki, ale wymaga to zużycia energii. Takim związkiem energetyvznym jest ATP kwas adezynotrójfosforanowy.

DYFUZJA UŁATWIONA - substancja, która chce wejść do komórki łączy się w obrębi błony z inna substancją zwaną nośnikiem. Tworzy się kompleks nośnik-cząsteczka, który, po przejąciu przez błony rozpada się. Cząsteczka zostaje w komórce. Nośnik wraca na swoje miejsce w błonie i czeka na ponowne tworzenie kompleksu.

Białka transportowe - Dużą grupę białek stanowią białka transportujące, które przenoszą małe cząsteczki lub jony. Takimi białkami są, m.in.: przenosząca lipidy albumina, gromadząca i przenosząca żelazo transferyna oraz podstawowy nośnik tlenu molekularnego — hemoglobina. Hemoglobina jest białkiem występującym obficie w czerwonych krwinkach (erytrocytach) i to właśnie dzięki jej obecności możliwe jest zwiększenie stężenia tlenu molekularnego w płynach ustrojowych o prawie dwa rzędy wielkości w stosunku do ilości tlenu zawartego pod ciśnieniem atmosferycznym w wodzie.


  1. Nukleotyd

Nukleotydy są cząsteczkami składającymi się z trzech grup: zasady azotowej, cukru i grup fosforanowych. W nukleotydach występują dwa różne cukry – ryboza i deoksyryboza, oba są pochodnymi pentozy, pięciowęglowej cząsteczki cyklicznej. Zasady azotowe spotykane w nukleotydach są pochodnymi puryny lub pirymidyny. Do zasad purynowych należą: adenina (A) i guanina (G), do pirymidynowych: uracyl (U), cytozyna (C) i tymina (T). Funkcje:

  • Nukleotydy są prekursorami DNA i RNA

  • Nukleotydy mogą być przenośnikami energii chemicznej

Nukleotydy posiadające kilka grup fosforanowych mogą pełnić rolę uniwersalnych przenośników energii. Takim związkiem jest ATP (adeninotrifosforan) posiadający trzy grupy fosforanowe. Przyłączenie ostatniej z nich wymaga dużego na kładu energetycznego. Ta energia uwalniana jest następnie przy przerywaniu tego wiązania. Tak więc cząsteczki ATP są w stanie magazynować energię lub przenosić ją w punkt odległy od miejsca jej syntezy. Nukleotydy adeninowe są składnikami trzech podstawowych koenzymów: NAD+, FAD i CoA Nukleotydy mogą pełnić w komórce rolę regulatorową. Replikacja DNA Replikacja DNA jest procesem zapewniającym przekazywanie informacji genetycznej z komórek rodzicielskich do komórek potomnych w sposób prawie doskonały za sprawą mechanizmu replikacji, a także dzięki systemom ochronnych, zdolnych do wykrywania i naprawy błędów. Podstawowa cecha replikacji jest jej semikonserwatywność. Znaczy to, że synteza nowych nici może zachodzić tylko z udziałem nici rodzicielskich, służących jako matryce. Mówiąc o replikacji należy wprowadzić pojecie replikonu. Replikon jest to jednostka replikacji, za która przyjęto uważać odcinek DNA, zawierający miejsce startu oraz przylegające sekwencje uczestniczące w kontroli tego procesu. W procesie replikacji można wyróżnić trzy zasadnicze etapy:

Nukleoid - obszar komórki prokariotycznej będący odpowiednikiem jądra komórkowego u Eukaryota. W przeciwieństwie do jądra komórek eukariotycznych nukleoid nie jest oddzielony od cytoplazmy otoczką jądrową. Zawiera genofor (chromosom bakteryjny), czyli pojedynczą, kolistą cząsteczkę dwuniciowego DNA o długości do 200 nm (0,6 –13 mln par zasad).

Plazmidy- samo replikujące się zamknięte, koliste cząsteczki dwuniciowego DNA, które replikują się niezależnie od głównego genoforu. Ich funkcją jest przekazywanie innym bakteriom genów kodujących oporność na różnego rodzaju antybiotyki.

Nukleoid wraz z plazmidami zawiera pełną informację genetyczną komórki


  1. Mezosom:

  • zbudowany z form błoniastych;

  • uwypuklenia błony komórkowej, będące efektem działań środków chemicznych używanych do mikroskopowania;

  • zakotwiczają nukleoid;

  • zawiera wiele enzymów (synteza ściany, oddychanie – cytochromy, procesy oksydoredukcyjne);

  • stanowi odpowiednik mitochondriów czyli jest centrum energetycznym(na ich powierzchni znajdują się przenośniki elektronowe), w którym wytwarzane jest ATP i zachodzi proces oddychania wewnątrzkomórkowego (tylko u bakterii tlenowych);

  • bierze udział w transporcie elektronów;

  • jest miejscem syntezy kwasów tłuszczowych.


  1. Budowa i funkcja ciał chromatoforowych (fotosyntez bakteryjna)

  • błoniaste pęcherzyki lub rurki;

  • często zawierają warstwo ułożony system błon wewnętrznych (budowa lameralna -warstwowa;

  • zawierają chlorofil, barwniki karotenoidowe białka i lipidy

  • występują u bakterii fotosyntezujących;

  • są centrami procesów fotosyntezy.

Istnieją też bakterie fotoautotroficzne, które substancje do swojego odżywiania „produkują” w sobie dzięki procesom fotosyntezy. Przekształcają one zredukowane związki mineralne przy użyciu energii świetlnej (chemoautotrofy posykiwały ją z reakcji chemicznych utleniania różnych związków) w związki organiczne i nie wydzielany jest tlen w tej reakcji. (tym między innymi różni się fotosynteza bakteryjna od fotosyntezy roślinnej). Wydzielane zaś są utlenione związki organiczne oraz utlenione związki mineralne.
U bakterii fotoautotroficznych występuje bakteriochlorofil będący zmagazynowany w tworach nazywanych tylakoidami lub chromatoforami. Fotosynteza bakteryjna przebiega zaś w widmie światła czerwonego, przy braku tlenu. Bakterie jednak zyskują w takim środowisku, potrzebne im do reakcji fotosyntezy, elektrony redukujące z zredukowanych związków wodoru, siarki a także niektórych kwasów organicznych.
Fotosyntezę przeprowadzać mogą tez sinice, one pobierają dwutlenek węgla z powietrza a wodór z wody, i ni podobnie do roślin wydzielają cząsteczkę tlenu
Bakterie fotosyntezujące zawierają chlorofil (sinice) lub bakterio-chlorofil (pozostałe) oraz karotenoidy. Duża liczba tych ostatnich, o zabarwieniu czerwonym i brązowym, może prowadzić do zamaskowania zielonego bakteriochlorofilu, jak dzieje się to u bakterii purpurowych. Sinice przeprowadzają fotosyntezę w sposób podobny do roślin, tzn. z udziałem wody jako źródła atomów wodoru, a co za tym idzie - z wydzielaniem tlenu. U bakterii zielonych i bakterii purpurowych źródłem atomów wodoru mogą być rożne związki nieorganiczne lub organiczne. Często związkiem takim jest siarkowodoru (nieorganiczny, H2S), a produktem powstającym po odebraniu wodoru - czysta siarka.

Różnice pomiędzy fotosynteza bakteryjną i zachodzącą u Eucaryota :

  • U bakterii występuje inny barwnik zielony tzw. Bakteriochlorofil

  • U bakterii nie zachodzi proces fotofosforylacji niecyklicznej.

  • Występuje u nich tylko fotofosforylacja cykliczna.

  • Fotosynteza bakteryjna zachodzi w warunkach beztlenowych(anaerobowych)

  • W fotosyntezie bakteryjnej nie zachodzi fotoliza wody, źródłem(donorem) elektronów redukujących bakteriochlorofil są inne związki takie jak siarkowodór, siarka, tiosiarczany czy wodór.

6CO2 + 12H2S - C6H12O6 + 12S + 6H2O

6CO2 + 6H2O C6H12 O6 + 6O2


  1. Materiał zapasowy w komórkach

Substancje, które można uważać za materiały zapasowe to:

  • polisacharydy,

  • tłuszcze,

  • polifosforany,

  • siarka.

Znajdują się one w komórce w postaci osmotycznie nieczynnej i są nierozpuszczalne w wodzie.

Do odkładania substancji zapasowych konieczne jest, aby w podłożu były obecne składniki potrzebne do ich syntezy. Po przywróceniu warunków sprzyjających wzrostowi substancje zapasowe mogą być ponownie włączone w metabolizm.

Występowanie polisacharydów;

  • ziarna glikogenu występują w komórkach E.coli, Salmonella, Bacillus, Micrococcus luteus.

  • Skrobię zawierają Acetobacter pasteurianus i wiele gatunków z rodzaju Neisseria.

  • granulozę (substancję podobną do skrobi) gromadzą bakterie z rodzaju Clostridium.

Substancje tłuszczowe występują u mikroorganizmów w postaci kropelek. U wielu bakterii te kropelki zawierają kwas poli-β-hydroksymasłowy ( PHB), poliester rozpuszczalny w chloroformie, nierozpuszczalny w eterze. Jest zbudowany z około 60 reszt kwasuβ-hydroksymasłowego. Może on stanowić aż 90% suchej masy komórki. Gromadzą go liczne bakterie tlenowe, sinice i beztlenowe bakterie fototroficzne. Produkowany jest w warunkach ograniczonego dostępu do tlenu, jako produkt fermentacji. Po przywróceniu warunków tlenowych PHB może zostać wykorzystany jako źródło węgla i energii w metabolizmie oksydacyjnym.

Wiele bakterii gromadzi w komórkach kwas fosforowy pod postacią ziaren polifosforanów, zwanych ziarnami wolutyny (po raz pierwszy opisano je u Spirillumvolutans).Fosforany zmagazynowane w ten sposób mogą być wykorzystane w przypadku ich braku w podłożu, umożliwiając komórce nawet kilkakrotne podziały lub wytworzenie przetrwalnika.
Siarkę w postaci silnie załamujących światło kuleczek gromadzą bakterie utleniające siarkowodór i siarczki do siarczanów .Ilość nagromadzonej siarki zależy od stężenia siarkowodoru. Przy jego braku nagromadzona siarka jest utleniana do siarczanu. Dla bakterii tlenowych siarka może być źródłem energii, dla beztlenowych donorem elektronów.


  1. Porównać komórkę pro i eukariotyczną

eukariota

składnik/ cecha

prokariota

+

błona komórkowa

+

+

cytoplazma

+

+

Rekombinacja genetyczna

+

mitochondrium

=

mezosom

rybosom

80S/70S

rybosom bakteryjny

+

jądro komórkowe

-

+

retikulum endoplazma tyczne

-

+

lizozym

-

+

mikrotubule

-

+

otoczka jądrowa

-

+

cytoszkielet

-

+

chloroplasty

-

+

aparat Gologiego

-

+

ruchy cytoplazmy

-

-

wić

+

-

plazmid

+

-

genofor

+

+/-

ściana komórkowa

+


prokariota

eukariota

-nie mają wyodrębnionego jądra otoczonego błoną, DNA występuje w cytoplazmie jako koliście zamknięta cząsteczka

-twór zwany nukleoidem tworzony przez splątek bardzo długiej (do 1000 razy dłuższej niż cały organizm),podwójnej helisy kwasy deoksyrybonukleinowego, zanurzony w cytoplazmie i bezpośrednio stykający się z jej składnikami

- wyraźnie wyodrębnione z cytoplazmy jądro komórkowe zawierające błonę jądrową, sok jądrowy, chromosomy i jąderko (jądro zawiera większą część genomu umieszczonego w zespole chromosomów)

-brak centrometru i centrioli, wrzeciona mitotycznego, brak mitochondriów, plastydów, lizosomów (ich funkcje spełniają inaczej i prościej ukszt. cząstki cytoplazmatyczne lub funkcje te są rozdzielone pomiędzy pozostałe układy komórkowe)

-brak retikulum endoplazmatycznego

-błona komórkowa inaczej zbudowana,inny układ ściany komórkowej u form ją posiadających

-chromosomy są replikowane w procesie zwanym mitozą, w chromosomach DNA jest poł. z zasadowymi białkami zwanymi histonami


-w komórce eukariotycznej znajdują się też organelle, jak mitochondria i chloroplasty (w roślinach)


-stosunkowo duże rybosomy eukariotyczne (80S)

-podział wnętrza na przedziały jest mniej wyraźny niż u eukariotów

-rybosomy stosunkowo małe (70S)

-stosunkowo słabo zróżnicowane morfologicznie, można wyróżnić jedynie kilka podstawowych kształtów, będących pochodnymi kuli i prostych lub zakrzywionych cylindrów


-różnorodność i zmienność właściwości metabolicznych

-istnieją grupy prokariotów, które mogą żyć beztlenowo, inne grupy zdolne do wykorzystania energii słonecznej i zdolne do syntetyzowania swojej materii komórkowej ze zw. organicznych lub CO2



  1. Skład chemiczny komórek

  1. skład chemiczny:

  • źródło węgla, które musi znajdować się w podłożu;

  • woda 70-86% suchej masy;

  • sucha masa: C:N:P 100:10:1

  • fosfor,

  • węgiel,

  • azot.

  • mikroelementy:

  • siarka,

  • cynk,

  • magnez,

  • żelazo,

  • mangan.

  1. skład organiczny:

  • białka (42- 63% suchej masy, wychodzą w skład organelli – fimbrii, rzęsek, rybosomów,

  • cukry – stanowią do 10% suchej masy, u bakterii przeważnie cukrowce spotykane są w postaci polimerów, element ściany komórkowej u bakterii Gram -, element błony cytoplazmatycznej i białek strukturalnych, pełni funkcje zapasowe, buduje woski u gruźlicy.

  • wielocukry, stanowią do 10% suchej masy, odgrywają rolę materiałów zapasowych komórki (skrobia, glikogen)oraz budulca, z jakiego zbudowane są sztywne ściany komórkowe bakterii i śluzowe substancje otoczkowe

  • tłuszcze – ich zawartość zależy od typu bakterii, ich skład odmienny niż u innych org.

  • kwasy nukleinowe – zbudowane z łańcuchów nukleotydowych (RNA – 15% suchej masy, DNA)

  • witaminy i czynniki wzrostowe ilościowo stanowią małą frakcję masy komórkowej ale jako niebiałkowe składowe wielu enzymów odgrywają rolę bardzo dużą.

  • składniki popiołowe – ich ilość zależy od gatunku ale przede wszystkim od warunków hodowli i składu podłoża


  1. Sposób pobierania pokarmu przez bakterie.

Pobór pokarmu zależy w pierwszym rzędzie od zdolności bakterii do samodzielnej syntezy składników komórkowych. Im więcej takich składników bakteria syntezuje, tym mniej ich potrzebuje jako niezbędnych w pokarmie. Dobór pokarmu zależy także od jego dostępności.

  • całą powierzchnią błony cytoplazmatycznej

  • DYFUZJA BIERNA - substancje przenikają zgodnie z gradientem stężeń tzn. z obszaru o wyższym stężeniu do obszaru o niższym stężeniu.

  • TRANSPORT AKTYWNY - cząsteczki przechodzą do komórki, ale wymaga to zużycia energii. Takim związkiem energetycznym jest ATP kwas adenozyno trójfosforanowy.

  • TRANSPORT UŁATWIONY (wbrew gradientowi stężeń) substancja, która chce wejść do komórki łączy się w obrębi błony z inna substancją zwaną nośnikiem. Tworzy się kompleks nośnik-cząsteczka, który, po przejąciu przez błony rozpada się. Cząsteczka zostaje w komórce. Nośnik wraca na swoje miejsce w błonie i czeka na ponowne tworzenie kompleksu.

Pobieranie pokarmu możemy podzielić na wykorzystanie pokarmu wielkocząsteczkowego i drobnocząsteczkowego:

  • Wielkocząsteczkowego - bakterie pobierają pokarm całą powierzchnią ciała okrytą ścianą komórkową i błoną cytoplazmatyczną. Bakterie nie potrafią wchłaniać cząstek w postaci cząstek czy kropelek, jak czynią to komórki eukariotyczne. Pobieranie pokarmu jest jednoznaczne z przeprowadzeniem go przez osłony komórkowe. Pobieranie musi być poprzedzone rozbiciem makrocząsteczek na pochodne związki drobnocząsteczkowe. Proces ten nazywamy trawieniem lub rozkładem i ma on najczęściej charakter hydrolizy i przebiega z udziałem enzymów. Bakterie muszą najpierw rozłożyć pokarm na zewnątrz komórki.

  • Wchłanianie zw. drobnocząsteczkowe- Jest on pobierany całą powierzchnią ciała, ściana komórkowa działa na zasadzie sita - przepuszcza cząstki drobnocząsteczkowe, a nie przepuszcza wielkocząsteczkowych, działa wybiórczo. Właściwym organem pobierającym pokarm jest błona cytoplazmatyczna - działa ona wybiórczo - wybiera to co jest jej potrzebne.
      Pobieranie pokarmu nie jest procesem biernym. Jednym z mechanizmów jest przenikanie na zasadzie wybiórczej rozpuszczalności w tłuszczach. Największe znaczenie - odżywianie przez przenośniki, czyli bakteria rozpoznaje związek, wiąże go za pomocą białek - białka wiążące (wiązanie następuje w błonie, przekaźniki przekazują pokarm do
    cytoplazmy, przekaźniki to peptydy cykliczne lub łańcuchowe).


  1. Źródła pierwiastków podstawowych

  • węgiel:

  • autotrofy- z dwutlenku węgla

  • heterotrofy – ze związków organicznych

  • azot:

  • sole amonowe, azotany/azotyny, (sole mineralne) - rośliny

  • azot atmosferyczny - bakterie symbiotyczne (np. brodawkowe z rodzaju Rhizobium); żyjące w warunkach tlenowych Azothobacter, beztlenowych Colstridium; sinice i grzyby.

  • aminokwasy (organiczne):

  • auksotrofy – maja dość duże wymagania odżywcze (dostarczenie gotowych składników).

  • fosfor

  • spotykamy go pod postacią nieorganiczną w formie jonu fosforanowego

  • siarka

  • chemoautotrofy – jon siarczanowe, siarczany tiosiarczany

  • auksotrofy – aminokwasy –cysteina i metionina; witaminy-biotyna


  1. Czy różnią się prototrofy od auksotrofów

Auksotrofy drobnoustroje, które do wzrostu muszą pobierać z zewnątrz jakąś substancję wzrostową której same nie umieją wytworzyć np. aminokwas, witaminy czy zasady purynowe.
Mogą powstawać w wyniku
mutacji szczepów drobnoustrojów mających zdolność do samodzielnego produkowania wyżej wymienionych czynników wzrostowych (prototrofy). Należą do nich salmonella, gronkowiec złocisty (Staphylococcus aureus). Są to organizmy, które wymagają więcej niż jednego związku.

Prototrofy - bardzo pierwotne organizmy prokariotyczne, heterotroficzne, pobierające z otoczenia proste związki chemiczne, od których dostępności zależy ich przetrwanie w danym środowisku. Są to np. pałeczki gram ujemne, laseczki tlenowe (Bacillus), laseczki beztlenowe (Clostridium), związkiem prostym mogą to być kwasy nukleinowe, aldehydy, ketony, alkohol, białka. W przeciwieństwie do auksotrofów wymagają tylko jednego związku.

Różnice:

Auksotrofy

Prototrofy

Skomplikowane, gotowe już związki chemiczne

Proste związki chemiczne

Wymagają więcej niż jednego związku

Wymagają tylko jednego związku



  1. Źródła fosforu i siarki

  • fosfor - jest czerpany przez bakterie w postaci, w której spotkamy go w związkach organicznych, a jako jon fosforanowych, który zwykle w pokarmie może mieć postać fosforanu nieorganicznego

  • siarka - większość bakterii czerpie siarkę z jonów siarczanowych, w związkach biogennych występuje w postaci zredukowanych grup sulfhydrylowych; siarczyny; gotowe związki, które zawierają siarkę; siarka zredukowana –siarczyny, tiosiarczany; związki organiczne zawierające siarkę - cysteina, metionina,biotyna

  • węgiel - heterotrofy i autotrofy


  1. Enzymy Enzymy są to biologicznie czynne białka, które regulują szybkość reakcji biochemicznych; przyspieszają reakcje, ale tylko te, które są termodynamiczne możliwe tzn. te, w który przebiegu wyzwala się energia, a produkty ostateczne zawierają mniej energii, niż wyjściowe. Obniżają energię aktywacji, same jednak nie ulegają przemianie, dlatego nie zużywają się bezpośrednio w wyniku reakcji. Enzymy są wysoce swoiste, tzn. działają tylko na określony, sobie właściwy substrat i katalizują tylko dana reakcję.. Większość enzymów składa się z: - części białkowej, czyli apoenzymu, - części niebiałkowej, czyli grupy prostetycznej lub koenzymu. Reakcje enzymatyczne Na powierzchni cząsteczki enzymu znajduje się zagłębienie będące miejscem wiązania substratu, nazwane centrum aktywnym. Przestrzenne dopasowanie substratu do centrum aktywnego enzymu umożliwia ich związanie i wytworzenie kompleksu enzym - substrat (E-S), a w efekcie obniżenie energii aktywacji reakcji, której następnie ulegnie substrat (energia aktywacji to taka ilość energii, która jest niezbędna do zapoczątkowania reakcji chemicznej). Ogólne równanie reakcji enzymatycznej katalizowanej przez enzym można zapisać w następujący sposób: ENZYM + SUBSTRAT ↔ KOMPLEKS E-S ↔ ENZYM + PRODUKT W ustaleniu odpowiedniej konformacji centrum aktywnego umożliwiającej utworzenie kompleksu E-S często biorą udział aktywatory, których role pełnią jony metali lub koenzymy. Na aktywność enzymów wpływają różne czynniki, wśród nich wymienić można temperaturę i pH. Wraz ze wzrostem temperatury rośnie szybkość reakcji enzymatycznych. Jednak po przekroczeniu pewnej wartości szybkość ta nagle spada, co jest wynikiem cieplnej denaturacji enzymu. Optymalna temperatura to taka, przy której szybkość katalizowanej reakcji jest największa. Nie można wyznaczyć takiej reguły w przypadku wpływu pH na aktywność enzymatyczną, ponieważ enzymy wykazują dużą różnorodność w zależności od środowiska, w jakim działają. Przykładem mogą być enzymy trawienne, spośród których amylaza ślinowa wykazuje optimum w środowisku obojętnym, pepsyna w kwaśnym, a trypsyna w zasadowym.

Enzymy dzielimy na grupy w zależności od typu przemian chemicznych przez nie wywołanych:

  • oksydoreduktazy – (dehydrogenazy, oksydazy) – Przenosza elektrony i wodory z substratu na jakiś akceptor

  • transferazy – transaminazy, przenoszą z jednego związku na drugi określona grupę chemiczną aminową, acetylową itp.

  • hydrolazy – rozkładają substrat na drodze hydrolizy, należą tu enzymy rozszczepiające białka- proteazy, celulozę-celulazy.

  • liazy – odszczepiają pewne grupy bez udziału hydrolizy

  • Izomerazy- enzym przebudowujący strukturę cząsteczki bez jej rozkładu

  • ligazy (syntetazy) – katalizują łączenie się 2 cząsteczek


  1. Wyjaśnić pojęcia:

Metabolizm- ogół procesów fizycznych i chemicznych oraz towarzyszące im przemiany energii zachodzące w żywych komórkach i stanowiące podstawę życia. Do podstawowych zadań metabolizmu należą:

  • dostarczenie substancji konstrukcyjnych

  • wytworzeni odpowiedniej ilości energii

  • stworzenie odpowiedniego potencjału redukcyjnego

  • zabezpieczenie organizmu przed raptownymi zmianami warunków środowiska

Źródłem energii jest energia zawarta w składnikach żywej komórki i odnawiane przez przyjmowanie;

  • pokarmu – heterotrofy

  • energii słonecznej – fotoautotrofy

  • energii utleniania prostych związków nieorganicznych - chemoautotrofy

Proces metabolizmu musi być stale kontrolowany, warunek ten jest spełniony przez liczne mechanizmy regulacyjne;

  • regulacja hormonalna i nerwowa

  • wytwarzanie enzymów pod kontrola genetyczną.

Metabolizm jest integralnie związane z organizmem żywym, ustaje dopiero w chwili śmierci. Dla podtrzymania metabolizmu każda komórka musi być układem otwartym, przez co w sposób ciągły przepływa materia i energia

Katabolizm – związany z rozkładem i pozyskiwaniem energii, rekcja egzoergiczna prowadząca do uwalniania energii. Powstające produkty mają niższy poziom energetyczny niż zużywane substraty, dochodzi do degradacji energetycznej.

Anabolizm – związany z syntezą i wzrostem komórki, stanowi reakcję syntezy złożonych związków organicznych z prostych związków. Reakcje te są endoergiczne tzn. aby zaszły potrzebna jest energia. Dzięki temu powstające produkty maja wyższy poziom energetyczny niż wykorzystywane substraty.


  1. Wyjaśnić pojęcia:

utlenianie biologiczne, oddychanie tkankowe, oddychanie komórkowe-

zespół reakcji biochemicznych zachodzących w żywych komórkach, dostarczających im niezbędnej energii; komórka pobiera tlen, a wydala dwutlenek węgla oraz wydziela ciepło; u większości organizmów odbywa się poprzez rozkład cukrów i tłuszczów oraz w cyklu Krebsa; z oddychaniem komórkowym sprzężone jest magazynowanie energii w postaci tzw. ATP (adenozynotrifosforanów), stanowiących centra gospodarki energetycznej komórki; oba te procesy zachodzą w każdej komórce, gł. w wewn. błonie mitochondrialnej.

Procesy utleniania katalizowane są przez enzymy oksydoredukcyjne przejmujące elektrony z utlenianych substratów organicznych na współdziałające z nimi koenzymy (np. FAD, NAD), za pośrednictwem których elektrony trafiają na ostateczne ich akceptory; akceptorami tymi mogą być inne związki organiczne lub mitochondrialny łańcuch oddechowy przenoszący elektrony na cząsteczki tlenu i generujący siłę protonomotoryczną

C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O + energia (38 ATP)

ATP, adenozynotrójfosforan, nukleotyd zbudowany z cukru-rybozy, zasady azotowej-adeniny i 3reszt kwasu fosforowego. ATP wchodzi w reakcje tylko w obecności kationów metali dwuwartościowych (np. Mn2+,, Mg2+), z którymi tworzy kompleksy. ATP powstaje z ADP w wyniku fosforylacji substratowej (fosforylacja) oraz w procesie chemiosmozy (fosforylacja oksydacyjna i fosforylacja fotosyntetyczna).

  • bierze udział w regulacji ciśnienia krwi oddziałując na receptory,

  • pełni funkcję akumulatora, jest przenośnikiem energii swobodnej (pełni rolę w wymianie, transporcie, magazynowaniu energii)

Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy NADnukleotyd pełniący istotną rolę w procesach oddychania komórkowego, pierwszy przenośnik odbierający elektron od dehydrogenaz ,.

  • uczestniczy w wielu procesach oksydacyjno – redukcyjnych związanych z katabolizmem i uwalnianiem energii

  • główny akceptor elektronów w reakcjach utleniania substratów w łańcuchu oddechowym,

NAD+ –(dinukleotyd nikotynoamidoadenininowy) jest koenzymem mającym strukturę opartą na adeninie i 2 cząsteczkach rybozy powiązanych grupami fosforanowymi i pierścieniem forma utleniona dinukleotydu , wiąże jeden proton i dwa elektrony .

  • przenosi elektrony

  • bierze udział w reakcjach oksydoredukcyjnych

  • jest używany w reakcjach katabolicznych

NADP+ –) jest koenzymem mającym strukturę opartą na adeninie i 2 cząsteczkach rybozy powiązanych grupami fosforanowymi i pierścieniem. Cząsteczka NADP+ różni się do NAD+ obecnością reszty fosforanowej przy węglu 2' rybozy nukleotydu adeninowego.

  • używany w reakcjach anabolicznych

  • przenosi elektrony

  • bierze udział w reakcjach oksydoredukcyjnych

Dinukleotyd flawinoadeninowy, FAD –jest syntetyzowany z ryboflawiny i 2 cząsteczek ATP. Jego reaktywna częścią jest pierścień izoalaksazynowy. Wraz z FMN jest pierwszym akceptorem wodoru w łańcuchu oddechowym. Może przyjmować 2 elektrony. Pełni funkcję przenośnika elektronów i protonów (kationów wodorowych). Przenosi dwa protony i dwa elektrony, w efekcie czego utleniona forma FAD przechodzi odwracalnie w formę zredukowaną FADH2. Mononukleotyd flawinowy, FMN, jest tak jak FAD syntetyzowany z ryboflawiny i 2 cząsteczek ATP. (ryboflawino-5'-fosforan). Wraz z FAD jest pierwszym akceptorem wodoru w łańcuchu oddechowym. Może przyjmować jeden elektron.


  1. Auto i heterotrofia

Autotrofy, organizmy samożywne - zdolne do syntetyzowania związków organicznych z prostych związków nieorganicznych, syntezują one cukrowce i złożone związki azotowe z dwutlenku węgla, wody i soli mineralnych. Pobierają w pokarmie jedynie utlenione związki węgla (kwas węglowy lub CO2) i przy przetwarzaniu w związki organiczne musi je zredukować. Proces redukcji związków powstających przy odżywianiu się CO2 pochłania energie i wymaga jej dopływu z zewnątrz. Źródłem tej energii może być:

  • energia świetlna, a organizmy które ją wykorzystują to fotoautotrofy. Należą do nich wszystkie rośliny zielone, glony, sinice i niektóre bakterie fotosyntezujące, bakterie purpurowe siarkowe (znajdując się w ciemności i w warunkach tlenowych mogą odżywiać się heterotroficznie, związkami organicznymi), niektóre pierwotniaki, glony, rośliny naczyniowe

  • energia uwalniana w czasie reakcji chemicznych. Energię uwalniana utlenianiu związków mineralnych wykorzystują chemolitotrofy, a typ odżywiania zwane jest chmosyntezą -bakterie nitryfikacyjne, siarkowe, żelazowe, wodorowe).

Heterotrofy organizmy cudzożywne, dla których źródłem energii wykorzystywanej do procesów życiowych jest pokarm w postaci gotowej materii organicznej. Należą do nich prototrofy i auksotrofy. Dla tych pierwszych niezbędny jest tylko jeden związek organiczny w pokarmie. Auksotrofy potrzebują poza tym jednym prostym związkiem organicznym jeszcze jakiegoś jednego lub wielu skomplikowanych związków organicznych np. witaminy albo aminokwasu. Prototrofy znajdziemy w środowisku ubogim w pokarm, jak gleba, czy woda. Heterotrofy dzieli się na

  • biofagi, tj. zjadające inne żywe organizmy lub ich tkanki,

  • się fitofagi (zjadające rośliny), czyli roślinożerców,

  • zoofagi (zjadające zwierzęta) – inaczej drapieżniki.

  • saprobionty żyjące w środowiskach zawierających rozkładające się szczątki różnych organizmów i odżywiające się martwą materią organiczną głównie pochodzenia roślinnego lub zwierzęcego Saprobionty dzieli się na:

  • mikrokonsumentów (bakterie, pierwotniaki, grzyby) nazywanych także reducentami, saprofitami lub osmotrofami,

  • makrokonsumentów (zwierzęta ), czyli saprofagi lub detrytofagi.

Te podstawowe grupy troficzne są dzielone następnie na podgrupy ze względu na rodzaj pobieranego pokarmu:

  • ksylofagi są to organizmy odżywiające się drewnem,

  • korpofagi – odżywiające się grzybami.

Heterotrofami są także wszystkie pasożyty odżywiające się kosztem roślin, roślinożerców i drapieżników. Również wśród roślin jest wiele heterotrofów, które nie mają chlorofilu i nie muszą syntetyzować materii organicznej, np. pasożyty roślinne i saprofity.

Autotrofy budują w swych komórkach złożone cząsteczki z prostych cząstek, takich jak dwutlenek węgla i woda. Heterotrofy z kolei potrzebują do ich produkcji substancji bardziej złożonych – monosacharydów czy aminokwasów.


  1. Typy procesów oddechowych u bakterii

oddychanie tlenowe – jest złożonym procesem, którego istotą jest oderwanie pary elektronów i odwodorowanie substratu przez specyficzne enzymy, dehydrogenazę i stopniowe przenoszenie elektronów przez szereg przenośników aż na tlen (ostatni biorca), przy czym każdemu etapowi przenoszenia elektronów towarzyszy wyzwolenie pewnej ilości energii

  • układy oksydacyjno – redukcyjne – zdolność do pobierania i oddawania elektronów wyrażam tak zwanym potencjałem oksydoredukcyjnym, związki które łatwo oddają elektrony, a tym samym łatwo ulegają utlenieniu nazywamy związkami redukcyjnymi, natomiast te, które mają większą zdolność pobierania określane są jako związki utleniające. Związki można ułożyć zależnie od ich potencjału redukcyjnego i tak te o najniższym będą oddawały sąsiedniemu o wyższym potencjale itd. aż do ostatniego związku, którym jest tlen. Związki, które przekazują elektrony od najbardziej zredukowanego dawcy do najbardziej utlenionego biorcy elektronów, nazywamy przenośnikami elektronów. Chemolitotrofy mogą jako dawców wykorzystywać nieorganiczne związki zredukowane.

  • łańcuch oddechowy- elektrony oderwane od substratu oddechowego wędrują przez kolejne przenośniki aż na ostateczny akceptor, którym w oddychaniu tlenowym jest tlen. Łańcuch przenoszenia elektronów nazywamy łańcuchem oddechowym, a kierunek przepływu elektronów wyznaczają wielkości potencjału redukcyjnego

  • dehydrogenazy – enzymy katalizujące utlenianie substratu w procesach oddechowych, odłączają od substratu po 2 elektrony i łącznie z nimi 2 protony, są wysoce specyficzne

Oddychanie tlenowe (aerobowe) (wzięte z tego co opracowali ludzie) jest wielostopniowym biochemicznym procesem utleniania związków organicznych związanym z wytwarzaniem energii użytecznej metabolicznie. Oddychanie przebiega w każdej żywej komórce w sposób stały. Zachodzi ono nawet wtedy, gdy inne procesy metaboliczne zostaną zahamowane. Chociaż istnieją różnice w przebiegu procesu oddychania u poszczególnych grup organizmów, to zestaw enzymów katalizujących poszczególne reakcje składające się na oddychanie jest zbliżony u wszystkich organizmów żywych. Energia uwolniona w procesie utleniania związków organicznych pojawia się częściowo w postaci związku wysokoenergetycznego – ATP

C6H12O6 + 6 H2O => 6CO2 + 6 H2O + energia

Podstawowy typ oddychania, przebiegający w normalnych warunkach we wszystkich komórkach żywych organizmów

Zasadnicze etapy oddychania komórkowego u organizmów eukariotycznych przebiegają w mitochondriach

Mitochondria - organelle występujące w cytoplazmie komórek eukariotycznych oddychających tlenowo

Mitochondria zbudowane są z dwóch błon: zewnętrznej i wewnętrznej oraz amorficznej macierzy (matriks) otoczonej wewnętrzną błoną mitochondrialną.

Liczba grzebieni mitochondrialnych (fałdów wewnętrznej błony mitochondrium) odzwierciedla stopień aktywności metabolicznej mitochondrium

Etapy oddychania tlenowego:

1. Glikoliza

przekształcenie glukozy w dwie trójwęglowe cząsteczki pirogronianiu

utworzenie ATP i NADH

2. Tworzenie acetylo-CoA

utlenianie pirogronianu do dwuwęglowej cząsteczki octanu, który łączy się z koenzymem A

uwolnienie CO2 i NADH

3. Cykl kwasu cytrynowego

przemiany acetylo-CoA prowadzące do uwolnienia CO2, ATP, NADH i FADH2

4. Łańcuch oddechowy

utworzenie ATP i wody

Oddychanie beztlenowe – Niektóre organizmy żywe czerpią energię wyłącznie z beztlenowego rozkładu związków organicznych, czyli fermentacji lub rozkładu związków nieorganicznych, na przykład azotanów lub siarczanów (oddychanie azotowe, siarczanowe. Takie organizmy mogą żyć w środowisku całkowicie pozbawionym tlenu. Przykładem jest żyjąca w ludzkim przewodzie pokarmowym Escherichia coli oddychająca (uzyskująca energię) poprzez redukcję azotanów do azotynów; inna bakteria, z rodzaju Desulfovibrio, redukuje siarczany do siarkowodoru. Wobec tego oddychanie beztlenowe jest spotykane tylko u bakterii, które wykorzystują utlenione związki mineralne jako akceptory elektronów.

Redukcja azotanów (denitryfikacja) DENITRYFIKACJA - redukcja azotanów do amoniaku (denitryfikacja częściowa) lub azotu cząsteczkowego (denitryfikacja całkowita) zachodząca w warunkach beztlenowych pod wpływem niektórych gat. bakterii glebowych i wodnych (zw. denitryfikatorami), np. Micrococcus denitrificans, Thiobacillus denitrificans; końcowy etap oddychania beztlenowego, w którym azotany są akceptorem atomów wodoru; denitryfikacja całkowita jest jednym z ogniw obiegu azotu w przyrodzie; nie jest korzystna dla rolnictwa, gdyż zuboża glebę w przyswajalny dla roślin azot; użyteczna przy biol. oczyszczaniu ścieków o dużej zawartości azotanów.

Paracoccus dentrificans:

2 NO32- + 4 H+=> 2 NO22- + 2 H2O

2 NO22- + 4 H+ =>2 NO + 2 H2O

2 NO + 2 H+ =>N2O + H20

N2O + 2H+ => N2 + H2O

Redukcja siarczanów

Desulfovibrio sp bakterie bezwzględnie beztlenowe, występują w osadach dennych zbiorników wodnych, w odach podziemnych, zwłaszcza w pobliżu złóż ropy naftowej. Substratem są kwasy organiczne, powstają duże ilości kwasu siarkowego:

SO44- + 8 H+ => H2S + H2O + 2 OH2-

Redukcja węglanów i CO2
Methanobacterium sp. (bakterie metanogenne) –akceptorem jest CO2 lub weglany, powstającym związkiem metan

8 H+ + CO2 =>CH4 + 2 H2O

Oddychanie beztlenowe występuje u prokariotów, które nie są zdolne do wykorzystywania tlenu jako końcowego akceptora elektronów. Takie organizmy zwane zwane są bezwzględnymi beztlenowcami. Inne mikroorganizmy prokariotyczne mogą wykorzystywać oddychanie beztlenowe , jeśli akurat nie ma tlenu w środowisku. W czasie oddychania beztlenowego powstaje mniej energii. Alternatywnymi akceptorami elektronów mogą być azotany, siarczany czy dwutlenek węgla.


  1. Omówić rozkład heksoz do stadium glikolizy

Jednym z najważniejszych procesów rozkładu heksoz jest glikoliza, gdzie w wyniku ciągu reakcji jedna cząsteczka glukozy zostaje przekształcona w dwie cząsteczki pirogronianu. GLIKOLIZA- Proces glikolizy zachodzi z udziałem jedenastu enzymów. Enzymy oraz wszystkie substraty dostarczane są do cytoplazmy komórki, gdzie proces ten się odbywa. Glikoliza jest przemiana beztlenową lecz może zachodzić również w warunkach tlenowych. Proces ten podzielony jest na dwa etapy.

I etap - dochodzi do ufosforylowania glukozy lub innego cukru będącego substratem glikolizy, np. fruktozy, sacharozy, glikogenu, skrobi. Do procesu tego zużywany jest ATP a produktem reakcji jest aldehyd 3-fosfoglicerynowy.

II etap - wyniku reakcji redukcji i utleniania powstaje kwas pirogronowy. W reakcji tej bierze udział dinukleotyd nikotynamidoadeninowy ( NAD+ ) a powstała energia kumulowana jest w cząsteczkach ATP.

glukoza + 2 Pi + 2 ADP + 2 NAD+ → 2 cząsteczki pirogronianu + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+ + 2 H2O

Zysk reakcji glikolizy wynosi: 2 cząsteczki ATP oraz powstanie pirogronianu

Etapy glikolizy:


Szlak Entnera – Doudoroffa – zachodzi bez glikolizy. Szlak ten funkcjonuje u wielu bakterii (Pseudomanas, Acetobacter). Rozpoczyna się od degradacji glukozy pod wpływem heksokinazy i powstaje utleniony glukozo - 6 – fosforan; dehydrogenaza przekształca go w 6- fosfoglukonian . Na skutek dehyroatazy powstaje 2-keto-3deoksy-6-fosfoglukonian (KDPG). W skutek rozszczepienia KDPG powstaje aldehyd 3-fosfoglicerynowy i pirogronian. Szlak ten dostarcza komórce prekursorów biosyntetycznych. Bilans to 2 cząsteczki pirogronianu i 1 cząsteczka ATP. Róznica między tym szlakiem, a glikolizą jest taka, iż oprócz związków 3-węglowych, mogą także powstawać 4, 5 i 7 węglowe, ponad to ułatwiają aktywacje własnych składników komórkowych.

Szlaku heksozomonofosforanowym (HMP), nazywanym też szlakiem pentozowym – bezpośrednio łączy się z glikolizą. Podstawowym zadaniem reakcji jest wytwarzanie NADPH i utlenianie glukozo-6-fosforanu do rybulozo-5-fosforanu. Utlenianie cząsteczki glukozy daje 36 cząsteczek ATP

  • utlenianie glukozo- 6-fosforanu do rybulozo- 5- fosforanu z jednoczesnym wytworzeniem dwóch cząsteczek NADPH

  • przejście rybulozo-5-fosforanu do rybozo-5-fosforanu

  • Powiązanie szlaku pentozofosforanowego z glikolizą

  • Jeśli zapotrzebowanie w komórce na NADPH jest większe niż na rybozo-5-fosforan, zostaje on przekształcony we fruktozo-6-fosforan i aldehyd 3-fosfoglicerynowy, które są metabolitami glikolizy, zgodnie przedstawionymi reakcjami.

  • Jeśli natomiast zapotrzebowanie na rybozo-5-fosforan jest znacznie większe niż na NADPH, transketolaza i transaldolaza przekształcają fruktozo-6-fosforan i aldehyd 3-fosfoglicerynowy, pobrane z glikolizy, w rybozo-5-fosforan.


  1. Rodzaje fermentacji

  • beztlenowa (właściwa) - beztlenowy rozkład substratu pokarmowego (cukru) w celu uzyskania energii (czyli rodzaj oddychania beztlenowego):

  • kwas octowy,

  • kwas cytrynowy,

  • kwas fumarowy

  • tlenowa – niepełny utlenianie substratu

  • kwas mlekowy;

  • kwas propionowy

Fermentacja mlekowa - homofermentacja, jedynym produktem jest kwas mlekowy. Fermentacja mlekowa jest procesem przemiany cukrów do produktów końcowych, wśród których dominuje kwas mlekowy. Pozostałe produktu to: kwas octowy, aldehyd octowy, etanol, CO2, acetoina, diacetyl, butandiol. Ze względu na szlaki przemian cukrów klasyfikuje bakterie mlekowe na:

  • homofermentatywne

  • heterofermentatywne

Przeprowadzają ja bakterie mlekowe:
-Leuconostoc - paciorkowce heterofermentatywne (Leuconostoc citrovorum - bywa używany jako dodatek do zakwasów przy wyrobie masła) - Lactobacillus - pałeczki homo- i heterofermentatywne (Lactobacillus bulgaricus - pałeczka bułgarska występująca w jogurcie, Lactobacillus viridescens - powoduje zielenienie mięsa peklowanego i surowych kiełbas). - Streptococcus - paciorkowce homofermentatywne (Streptococcus lactis paciorkowiec mlekowy, Streptococcus cremoris - paciorkowiec śmietanowy)

Równanie sumaryczne właściwej fermentacji mlekowej
C6H12O6 + bakterie mlekowe => 2CH3CHOHCOOH + 22,5 kcal
(cukier prosty -> kwas mlekowy + energia) Fermentacja propionowa - fermentacja wywoływana przez bakterie propionowe - należą do rodzaju Propionibacterium, - mają kształt pałeczek, - są względnymi beztlenowcami, - nie wytwarzają przetrwalników, - mają zastosowanie przy produkcji serów dojrzewających, np. sera edamskiego (wytwarzający się kwas octowy i propionowy nadają serom charakterystyczny, nieco ostry smak, a dwutlenek węgla powoduje powstawanie dziurek w serze), - bakterie te towarzyszą bakteriom mlekowym w zakwasach chlebowych, a niekiedy też w kiszonkach. Równanie sumaryczne fermentacji propionowej
CH3CHOHCOOH + bakterie propionowe => 2CH3CH2COOH + CH3COOH + CO2 + H2O + kcal
(kwas propionowy + bakterie → kwas octowy + energia)
Fermentacja octowa, proces utleniania alkoholu etylowego i innych alkoholi do kwasu octowego, katalizowany przez enzymy bakteryjne wytwarzane przez rodzaj Acetobacter:

Fermentacja masłowa – wywołują ja bezwzględne beztlenowce, przetrwalnikujące, gramdodatnie laseczki, Clostridium butrycium. Substratem obok cukrów prostych i dwucukrów jest także skrobia, pektyny, celuloza. Podczas heterofermentacji oprócz kwasu masłowego powstaje także : kwas octowy, alkohol etylowy i metan.

C6H12O6 -> CH3CH2CH2COOH + 2C02 + 2H2 + energia


  1. Czym się różni homofermentacja od hetero fermentacji

Homofermentacja – powstaje jeden produkt:

  • fermentacja mlekowa właściwa – jedyny powstającym produktem jest kwas mlekowy

  • fermentacja alkoholowa – (Saccharomyces) – powstaje etanol

Heterofermentacja – powstają więcej niż dwa produkty :

  • fermentacja mlekowa – produktami tej fermentacji są; kwas mlekowy, etanol i CO2, powodują ja niektóre bakterie mlekowe, np. Lactobacillus plantarum, L. brevis

  • f. masłowa – Clostridium

  • propionowa - Propionibacterium, powstaje kwas propionowy, octowy, bursztynowy

  • f. acetonowa – wywołana przez niektóre Colstridia –aceton, butanol, CO2, H2


  1. Oddychanie beztlenowe z redukcja związków mineralnych

Oddychanie beztlenowe – ostatecznym biorcą elektronów jest zewnątrzpochodny związek organiczny (fumaran) lub utleniony związek nieorganiczny (azotan, siarczan, węglan). ATP powstaje w wyniku fosforylacji oksydatywnej. Łańcuch oddechowy krótszy niż przy oddychaniu tlenowym. Proces ten jest bardziej wydajny niż fermentacja, mniej wydajny w porównaniu z oddychaniem tlenowym.

-Redukcja azotanów do azotynów, NO, N2O, N2 lub NH3 Gazowe produkty opuszczają środowisko -- deniryfikacja - redukcja azotanów do amoniaku (denitryfikacja częściowa) lub azotu cząsteczkowego (denitryfikacja całkowita) zachodząca w warunkach beztlenowych pod wpływem niektórych gat. bakterii glebowych i wodnych (zw. denitryfikatorami), np. Micrococcus denitrificans, Thiobacillus denitrificans; końcowy etap oddychania beztlenowego, w którym azotany są akceptorem atomów wodoru; denitryfikacja całkowita jest jednym z ogniw obiegu azotu w przyrodzie; nie jest korzystna dla rolnictwa, gdyż zuboża glebę w przyswajalny dla roślin azot; użyteczna przy biol. oczyszczaniu ścieków o dużej zawartości azotanów. desulfurykacja –(MIkrococcus, Pseudomonas) NH3,NO2-, N2 redukcja węglanów Methanobacterium sp. (bakterie metanogenne) –akceptorem jest CO2 lub weglany, powstającym związkiem metan


  1. Przekształcenie pirogronianu do ostatniego produktów w oddychaniu tlenowym.

Cykl Krebsa.

Cykl Krebsa, czyli cykl kwasu cytrynowego to cykl przemian metabolicznych, który przebiega w komórkach wszystkich organizmów oddychających tlenem. Został on odkryty w 1937 roku przez Hansa Krebsa i to od nazwiska tego biochemika bierze się jego nazwa.
Cykl Krebsa u eukariontów zlokalizowany jest wewnątrz mitochondriów - ważnych organelli komórkowych (u prokariontów przebiega w cytoplazmie). Składa się on z 9 etapów, katalizowanych przez 8 odrębnych enzymów (dwa etapy katalizuje ten sam enzym).
Zadaniem cyklu Krebsa jest utlenić związek o nazwie: acetylokoenzym A (acetylo-CoA) do 2 cząsteczek dwutlenku węgla (CO2), a pozyskaną w tym procesie energię ulokować w chemicznych nośnikach energii: GTP, NADH i FADH2.
Sumaryczny wzór cyklu Krebsa to:
acetylo-CoA + GDP + Pi + 3NAD+ + FAD + 2H20 → koenzym-A + GTP + 3NADH + 3H+ + FADH2 + 2CO2
Podczas jednego, pełnego obrotu cyklu Krebsa powstają 3 cząsteczki NADH, jedna cząsteczka FADH2 i jedna cząsteczka GTP. Najbardziej wszechstronnym nośnikiem energii w komórce jest ATP. GTP jest łatwo zamieniany na ATP przez odpowiedni enzym. Natomiast NADH i FADH2 biorą udział w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym - przemianie, która zamienia energię tych zredukowanych związków na energię wiązań ATP. Niezbędnym uczestnikiem łańcucha oddechowego jest tlen.
Jedna cząsteczka NADH pozwala wyprodukować 3 cząsteczki ATP, a jedna cząsteczka FADH2 - 2 cząsteczki ATP. Nietrudno więc obliczyć, że jeden pełny obrót cyklu Krebsa pozwala wytworzyć 12 cząsteczek ATP - uniwersalnego nośnika energii dla komórki (3 x 3 + 1 x 2 + 1 = 12).






















Acetylokoenzym A jest cząsteczką centralną dla metabolizmu tlenowców. Jest on produktem deaminacji wielu aminokwasów, cząsteczką końcową tzw. beta-oksydacji kwasów tłuszczowych, a także związkiem, w który przeprowadzany jest pirogronian - produkt glikolizy monocukrów.
A więc to dzięki tej "zbiorczej" cząsteczce, komórka może uzyskiwać energię zarówno z aminokwasów (składniki białek), jak i z tłuszczów i cukrów.
Zauważmy, że drugim substratem, do którego przyłączany jest acetylo-CoA na początku cyklu Krebsa, jest szczawiooctan. Ale mamy tu do czynienia z cyklem, czyli szczawiooctan jest także jednym z produktów końcowych. Cały cykl bierze zatem udział w utlenianiu acetylokoenzymu A, ale pozostaje on niezmienny dzięki swojej cykliczności (koniec przechodzi w początek). Jeśli coś uczestniczy w reakcji, a mimo to nie zmienia się, to jest to katalizator. A więc możemy traktować cały cykl Krebsa jak jeden, złożony katalizator.


  1. Łańcuch oddechowy w oddychaniu tlenowym

W przypadku oddychania tlenowego na wskutek utleniania biologicznego z utlenionego substratu za pośrednictwem enzymu dehydrogenazy. Przy reakcjach utlenienia substancji organicznych najczęściej dochodzi do oderwania dwóch atomów wodoru od utlenianego związku, co nosi nazwę reakcji odwodorowania. Poszczególne procesy utleniania są tylko składowymi ogólnie pojętej reakcjo oksydoredukcyjnej. Przy utlenienie jednego związku zachodzi jednocześnie redukcja innego, gdyż oderwane od ultenianego związku elektrony są przyłączane do związku podlegającego redukcji. Wielkością określającą zdolność do przyjmowania i oddawania elektronów jest potencjał oksydoredukcyjny. Związek oddający elektrony jest określany jako reduktor, a związek przyjmujący elektrony jest utleniaczem. Jak wcześniej wspomniano enzymem katalizującym oderwanie dwóch elektronów i dwóch protonów wodorowych jest dehydrogenaza, odznaczająca się wysokim stopniem specyficzności, dzięki czemu katalizuje reakcje utlenienia tylko specyficznego dla niej substratu. Oderwane elektrony są przenoszone za pośrednictwem odpowiednich związków określanych przenośnikami elektronowymi na atom tlenu, ulegający w ten sposób redukcji i w postaci cząsteczki wydzielany jest do atmosfery.

W reakcji przeniesienia elektronów i protonów wodorowych na atom tlenu wydziela się duża porcja energii. Dlatego też cały proces transportu elektronów na tlen odbywa się za pośrednictwem związków takich jak koenzymy NAD, FAD oraz szeregu cytochromów, które razem tworzą tzw. łańcuch oddechowy. Na poszczególnych etapach transportu elektronów na cząsteczkę tlenu dochodzi to stopniowego uwalniania energii, która następnie posłuży przy reakcjach syntezy komórkowej. Wydzielana energia magazynowana jest w wysokoenergetycznych i łatwo dostępnych cząsteczkach ATP, które zużywane są trakcie kolejnych przemian. Niewielka ilość energii wydzielana jest w postaci ciepła.
Oddychanie (nie mylić z wymianą gazową!) jest procesem uwalniania energii zawartej w związkach organicznych. Może odbywać się przy pomocy tlenu z wydzielaniem CO2 i wody:

C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O + energia

W taki sposób oddychają bezwzględne tlenowce (aeroby), które żyją tylko w obecności tego pierwiastka. Względne beztlenowce (anaeroby) są w stanie istnieć w przy niewielkich stężeniach tlenu, jednak energie czerpią z oddychania beztlenowego poprzez proces fermentacji bądź redukcji.


  1. Rozmnażanie bakterii (więcej informacji na ten temat w zeszycie Darii)

  • podział poprzeczny – z jednej komórki powstaja dwie identyczne, jedno pokolenie

  • pączkowanie (Hyphomicrobium sp, Rhodomicrobium sp)

  • fragmentacja nitek (promieniowce –bakterie przypominające grzyby, tworzą pseudogrzybnię, np. Nocardia sp. –jej fragmentacja w osadzie czynnym powoduje spienienie, wytwarza środki powierzchniowo czynne

  • pseudokonidia (promieniowce np. Stereptomyces sp. – wytwarza antybiotyki

  • rozpad nitek na komórki (pływki) – bakterie nitkowe opatrzone pochewkami np. Sphaerotilus natans – występuja w osadzie czynnym, odpowiedzialne za puchniecie osadu

  • tworzenie komórek gonidialnych (pseudokonidiów) przez końcową komórkę nitki (bakterie nitkowate opatrzone pochewkami np. Crenothrix sp.

  • tworzenie ciałek elementarnych

  • Chlamydie – bakterie bardzo małe

  • mikoplazmy- nie mają ściany komórkowej, najmniejsze tworzą formy przetrwalnikowe – ciałka elementarne

  • rozpad ciał olbrzymich (mikoplazmy)


  1. Mikroflora autochtoniczna i allochtoniczna

Mikroflora autochtoniczna wód - drobnoustroje naturalnie bytujące i rozmnażające się w środowisku wodnym.

Bakterie autochtoniczne

Wyróżniamy wśród nich: fotoautotrofy, chemoautotrofy i chemoorganotrofy.

- Bakterie fotosyntetyzujące (fotoautotrofy)

Wśród autotrofów fotosyntetyzujacych znajdują się bakterie purpurowe i zielone. Bakterie

purpurowe z uwagi na metabolizm dzielimy na następujące grupy:

Bakterie zielone nitkowate (Chloroflexaceae),

Bakterie zielone siarkowe (Chlorobiaceae),

Bakterie purpurowe siarkowe (Chromatiaceae i Ectothiorhodaceae),

Bakterie purpurowe niesiarkowe (Rhodospirillaceae),

Heliobakterie (Heliobacteriaceae).

Fotosynteza bakteryjna przebiega nieco odmienne w porównaniu do fotosyntezy roślinnej.

Jest to przede wszystkim proces beztlenowy i wymaga obecności zredukowanych związków mineralnych oraz nie towarzyszy jej wydzielanie tlenu, lecz powstawanie utlenionych związków nieorganicznych lub organicznych. Barwniki asymilacyjne bakterii odznaczają się zdolnością do absorpcji światła w zakresie fal długich (podczerwieni) niepochłanianych przez rośliny zielone. Działalność fotosyntetyczną w wodach powierzchniowych prowadzą głównie glony i rośliny wyższe

natomiast fotosynteza bakteryjna ma mniejsze znaczenie.

- Bakterie chemosyntezujące (chemoautotrofy)

Chemoautotrofy czerpią energię z procesu utleniania związków nieorganicznych. W zależności od natury utlenianego substratu wyróżniamy: bakterie nitryfikacyjne, żelaziste, siarkowe i wodorowe.

Rola bakterii nitryfikacyjnych w wodach polega głównie na utlenianiu jonów amonowych i azotynów a tym samym ich usuwaniu. Związki te w większych ilościach mogą być szkodliwe dla organizmów wodnych oraz zdrowia człowieka (w przypadku pobierania takiej wody do celów wodociągowych). Ponadto, wytwarzanie przez te bakterie azotanów jest podstawowym procesem dostarczającym roślinom wodnym najkorzystniejszego dla nich źródła azotu.

Bakterie żelaziste rozwijają się w wodach o zawartości żelaza dwuwartościowego w zakresie 0,15-8,5 mg/dm3, a ich niekorzystny wpływ może wynikać z „obrastania” przez nie różnych przedmiotów znajdujących się w wodzie (kamienie, liście i łodygi roślin podwodnych, powierzchnie skrzeli ryb i narybku). Ujemna ich rola polega także na tym, że przyczyniają się do korozji i zarastania rur kanalizacyjnych czy wodociągowych oraz różnych konstrukcji metalowych. Najbardziej rozpowszechnione bakterie żelaziste Leptothrix ochracea i Crenothrix polyspora należą do bakterii

nitkowatych, które charakteryzują się tym, że pojedyncze komórki tworzą nitki, otoczone cieńszą lub grubszą pochewką utworzoną z galaretowatej substancji. Odkładane w komórkach związki żelaza zabarwiają nitki na kolor żółty lub ciemnobrązowy. Bakterie żelaziste w wodach słodkich występują bardzo licznie. Szczególnie w wodzie studziennej i źródlanej, gdzie dostrzec można większe ich skupienia. Masowo występują niekiedy w błotnistych potokach, moczarach i stawach.

Bakterie siarkowe występują głównie w wodach zawierających siarkowodór, który dla większości drobnoustrojów jest toksyczny a dla nich stanowi warunek egzystencji. Spotyka się je w źródłach mineralnych zawierających siarkowodór pochodzenia geologicznego oraz w wodach silnie zanieczyszczonych, gdzie powstaje on jako produkt beztlenowego rozkładu białek. Typowymi przedstawicielami bakterii siarkowych są: bakteria poruszające się ruchem ślizgowym Beggiatoa alba

oraz przytwierdzona do podłoża Thiothrix nivea. Formy pojedyncze bakterii siarkowych to:

Thiobacillus thioparus – odkłada siarkę pochodzącą z utlenienia tiosiarczanów,

Thiobacillus thiooxidans – rośnie w środowisku kwaśnym przy pH 1,0-4,0,

Thiobacillus ferroxidans – oprócz tiosiarczanów i tetrationianów ma zdolność do

utleniania soli żelazawych,

Thiobacillus denitrificans - jest względnym beztlenowcem i wykazuje zdolność

wykorzystywania azotanów jako elektronobiorców przy utlenianiu siarkowodoru.

W warunkach tlenowych funkcje tę spełnia tlen.

Bakterie wodorowe posiadają zdolność utleniania wodoru z wykorzystaniem tlenu cząsteczkowego jako ostatecznego akceptora elektronów. Najczęściej odżywiają się jednak heterotroficznie, na samożywny tryb życia przechodzą dopiero, gdy w środowisku pojawi się wodór. Najbardziej rozpowszechnione są gatunki należące do rodzaju Hydrogenomonas. Do bakterii wodorowych zaliczyć można Micrococcus denitrificans przeprowadzający utlenianie wodoru przy równoczesnej redukcji azotanu do azotu cząsteczkowego a także Desulfovibrio desulfuricans przeprowadzające

utlenianie wodoru przy równoczesnej redukcji siarczanu do siarkowodoru.

Bakterie heterotroficzne (chemoorganotrofy)

Przeważająca część bakterii autochtonicznych występujących w zbiornikach wodnych to bakterie chemoorganotroficzne należące do grupy saprofitów, odżywiających się martwą materią pochodzenia roślinnego i zwierzęcego. Do typowych bakterii utrzymujących się w całej masie wody, to jest w postaci bakterioplanktonu, należą urzęsione pałeczki Gram-ujemne, reprezentujące takie rodzaje jak: Pseudomonas, Achromobacter, Alcaligenes, Vibrio i Aeromonas, a także Gramdodatnie ziarniaki z rodzaju Micrococcus, krętki oraz bakterie spiralne z rodzaju Spirillum Na podwodnych częściach roślin wyższych, a także na podwodnych cząstkach stałych osiedlają się liczne bakterie stylikowe (np. Caulobacter), pochewkowe, nitkowate, a także pączkujące (np. Hyphomicrobium), które tworzą perifiton. W osadach dennych rozwijają się zazwyczaj beztlenowe bakterie gnilne, beztlenowe. bakterie celulolityczne, oraz liczne chemoorganotrofy beztlenowe takie jak np. bakterie z rodzaju Desulfovibrio, które redukują siarczany do siarkowodoru, oraz nie mniej liczne - beztlenowe bakterie metanogenne, które redukują różne związki organiczne do metanu.

Bakterie allochtoniczne – pochodzące z zewnątrz

Wody o dużej żyzności, a także silnie zanieczyszczone wody powierzchniowe obfitują w pochodzące z zewnątrz bakterie saprofityczne i pasożytnicze wśród których najliczniej reprezentowaną grupą są Gram-ujemne pałeczki jelitowe Escherichia coli oraz bakterie z rodzaju Proteus, Klebsiella i Enterobacter, a także pałeczki z gatunku Pseudomonas aeruginosa oraz rodzaju Arthrobacter czy Corynebacterium. Ponadto, do allochtonicznych bakterii wodnych należy zaliczyć Gram-dodatnie laseczki z rodzaju Bacillus i Clostridium, które są wypłukiwane z gleby.

  • Przedostają się do zbiorników wodnych podczas silnych opadów wraz ze spływem powierzchniowym.

  • Źródłem bakterii chorobotwórczych (patogennych) są głównie ścieki miejskie. Do wód przedostają się także na drodze infiltracji i spływów powierzchniowych bakterie patogenne pochodzące z gleby.

  • Rola powietrza w zakażeniu wody jest istotna w zasięgu gęsto zaludnionych miast i okręgów przemysłowych. W zakażeniu główną rolę odgrywają bakterie zawieszone w powietrzu w postaci bioaerozoli lub pyłu bakteryjnego. Wraz z opadami przedostają się one do wód powierzchniowych.


  1. Bakterie chorobotwórcze przenoszone drogą wodną

Do najbardziej typowych bakterii bezwzględnie chorobotwórczych pojawiających się

w zanieczyszczonych wodach powierzchniowych należą

  • pałeczki duru brzusznego, czyli pałeczki z gatunku Salmonella typhi,

  • a także inne Gram-ujemne bakterie z rodzaju Salmonella, które są przyczyną różnorodnych zakażeń przewodu pokarmowego, objawiających się wymiotami i biegunką.

  • Nieco rzadziej w zanieczyszczonych zbiornikach wodnych występują Gram-ujemne pałeczki z rodzaju, Shigella, które powodują czerwonkę bakteryjną.

W krajach tropikalnych, w wodach powierzchniowych często spotyka się bakterie z gatunku, Vibrio cholerae, czyli przecinkowce cholery.

Ponadto w wodach zanieczyszczonych spotyka się prątki gruźlicy Mycobacterium tuberculosis oraz krętki z rodzaju, Leptospira. Te ostatnie bakterie wywołują żółtaczkę bakteryjną.

Poza wymienionymi bakteriami bezwzględnie chorobotwórczymi w wodach powierzchniowych są liczne bakterie Gram-ujemne, które określa się mianem drobnoustrojów oportunistycznych, czyli warunkowo chorobotwórczych. Należą one do rodzajów Pseudomonas, Aeromonas, Klebsiella, Flavobacterium, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Acinetobacter, Proteus i Providencia. Wszystkie te pałeczki wchodzą w skład normalnej flory jelitowej i nie są w zasadzie chorobotwórcze, o ile bytują one w przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt. W pewnych przypadkach bakterie te przedostają się jednak z przewodu pokarmowego do innych narządów i wówczas mogą stać się przyczyną wielu chorób np. zapalenia układu moczowego, zapalenia dróg oddechowych, a także posocznicy, czyli uogólnionego zakażenia wszystkich narządów wewnętrznych.


  1. Wirusy i pierwotniaki przenoszone droga wodną

Wirusy

Oprócz bakterii chorobotwórczych wody powierzchniowe, do których odprowadzane są

ścieki bytowo-gospodarcze zawierają zawsze znaczne ilości innych drobnoustrojów

chorobotwórczych np. wirusa polio, który powoduje porażenie dziecięce, czyli chorobę

Heinego-Medina. Nawet w nieznacznie zanieczyszczonej wodzie rzecznej występują

enterowirusy, które wywołują schorzenia jelit.

Wirusy jelitowe, które mogą być przenoszone przez wodę

i choroby przez nie wywoływane

Wirusy

Liczba typów

Postacie i zespoły chorobowe


Poliovirus

3

Porażenia, zapalenie opon mózgowych, gorączka

ECHO

34

Zapalenie opon mózgowych, choroby układu oddechowego, wysypka, biegunka, gorączka

Coxsackie A

23

Herpangina, choroby układu oddechowego, zapalenie opon mózgowych, gorączka

Coxsackie B

6

Zapalenia mięśnia sercowego, wrodzone wady serca, wysypka, gorączka, zapalenie opon mózgowych, choroby układu oddechowego, pleurodynia

Enterowirusy

4

Zapalenie opon mózgowych i mózgu, choroby układu oddechowego, ostre krwotoczne zapalenie spojówek, gorączka

Wirus wzw A

1

Wirusowe zapalenie wątroby

Wirus Norwalk

1

Epidemiczne biegunki, gorączka

Parwowirusy

3

Towarzyszą chorobom układu oddechowego

Adenowirusy

41

Choroby układu oddechowego, zakażenia oczu, biegunki

Rotawirusy

4

Epidemiczne biegunki (głownie u dzieci)

Reowirusy

3

Choroby dróg oddechowych


Pierwotniaki

Zanieczyszczona woda może być przyczyną schorzeń przewodu pokarmowego

spowodowanych przez pierwotniaki. Większość pasożytniczych pierwotniaków produkuje cysty, które są w stanie przetrwać poza organizmem gospodarza w niekorzystnych warunkach środowiskowych. Gdy warunki te ulegają poprawie z cyst rozwijają się tzw. trofozoity, postacie wegetatywne występujące u człowieka.



Pierwotniak chorobotwórczy

Choroba

Objawy


Giardia lamblia(wiciowiec)



giardioza

Chroniczne biegunki, skurcze brzucha, wzdęcia, ubytek masy ciała, zmęczenie

Cryptosporidium parvum

(sporowiec)


kryptosporidioza

Bóle brzucha, brak łaknienia, wodniste biegunki, ubytek masy ciała

Entamoeba histolytica

(korzenionóżka)


amebioza

Od łagodnej biegunki z krwią i śluzem do postaci ostrej z biegunką, gorączką i dreszczami

Acanthamoeba castellani

(korzenionóżka)


Pełzakowate zapalenie opon

mózgowych i mózgu


Objawy ze strony centralnego układu nerwowego



Naegleria gruberi

(korzenionóżka)


Pełzakowate zapalenie opon

mózgowych i mózgu


Przedostaje się przez nos do mózgu ludzi kąpiących się, wywołuje ostre objawy zapalenia mózgu i opon mózgowych, kończące się śmiercią zakażonego osobnika

Balantidium coli

(orzęsek)


Czerwonka balantydiowa


Krwawa biegunka z powodu owrzodzenia ścian jelita grubego, w które wwierca się orzęsek



  1. Omówić organizmy wskaźnikowe

Obowiązujące normy oparte są na pośrednim wnioskowaniu o obecności mikroorganizmów chorobotwórczych na podstawie liczebności w wodzie bakterii wskaźnikowych, które stale żyją jako saprofity w przewodzie pokarmowym człowieka i zwierząt wyższych. Ich obecność w wodzie świadczy o jej zanieczyszczeniu fekalnym, a zatem również o niebezpieczeństwie zakażenia wody mikroorganizmami chorobotwórczymi. Bakterie pełniące rolę wskaźników sanitarnych powinny spełniać następujące warunki:

h) muszą być stale obecne w przewodzie pokarmowym człowieka, co pozwala zawsze na

wykrycie kałowego zanieczyszczenia wody,

i) do grupy organizmów wskaźnikowych powinny także należeć formy nie

przetrwalnikujące, co umożliwia wykrycie świeżego fekalnego zanieczyszczenia wody,

j) ich identyfikacja musi być możliwa przy użyciu łatwo dostępnych metod,

k) długość życia bakterii wskaźnikowych w środowisku zewnętrznym musi być większa

niż długość życia gatunków chorobotwórczych,

l) liczebność bakterii wskaźnikowych w jelicie człowieka i kale powinna być duża;

m) nie powinny się one rozmnażać w środowisku wodnym.

Jakie bakterie wskaźnikowe wykorzystywane są do oceny jakości zdrowotnej wody?

W rutynowej pracy laboratoriów, prowadzących nadzór sanitarno-epidemiologiczny,

niemożliwe jest stałe badanie wody w kierunku wykrywania wszystkich drobnoustrojów

chorobotwórczych i potencjalnie chorobotwórczych, które mogą w niej występować.

Dlatego też badania rutynowe koncentrują się przede wszystkim na wykrywaniu bakterii

wskazujących na kałowe zanieczyszczenie wody. Do oceny jakości sanitarnej wody

wykorzystywana jest mikroflora saprofityczna zasiedlająca jelito grube człowieka.

Przyjęto następujące wskaźniki fekalnego zanieczyszczenia wody:

bakterie grupy coli,

bakterie grupy coli typu fekalnego,

paciorkowce kałowe,

laseczki z rodzaju Clostridium, redukujące siarczyny

oraz w niektórych przypadkach

gronkowce koagulazo-dodatnie,

Pseudomonas aeruginosa.

Bakterie z grupy coli

Bakterie grupy coli to przede wszystkim szczepy Escherichia coli oraz drobnoustroje z

rodzaju Enterobacter, Citrobacter i Klebsiella. Wykrywane są one na podłożach z laktozą

po inkubacji w temperaturze 37 oC. i tylko te nieliczne szczepy z rodzajów Enterobacter, Citrobacter i Klebsiella, które mają

zdolność fermentacji laktozy w temperaturze 44 oC.

Obecność w badanej próbce wody bakterii grupy coli lub bakterii grupy coli typu

kałowego świadczy o stosunkowo świeżym zanieczyszczeniu wody kałem, ściekami,

glebą lub gnijącym materiałem roślinnym. W zasadzie dla większości rodzajów wód

zalecane jest oznaczanie liczby bakterii obu grup coli.

Paciorkowce kałowe

Paciorkowce kałowe charakteryzują się nieco dłuższym okresem przeżywalności

w środowisku wodnym i większą opornością na środki dezynfekcyjne, niż bakterie grupy

coli. Termin ten obejmuje drobnoustroje z rodzajów Enterococcus i Streptococcus

należące do grupy serologicznej Lancefield D.

Stwierdzenie obecności paciorkowców kałowych w badanej próbce wody w liczbie

znacznie przewyższającej liczbę bakterii grupy coli, sugerować może zanieczyszczenie

wody kałem zwierzęcym lub ściekami, pochodzącymi z ferm hodowlanych.

Laseczki z rodzaju Clostridium

O starym, odległym w czasie zanieczyszczeniu kałowym może świadczyć wykrycie

w badanej próbce wody bakterii redukujących siarczyny (głównie szczepy Clostridium

perfringens); ich przetrwalniki mogą zachować żywotność przez wiele lat

w niesprzyjających warunkach. Clostridia redukujące siarczyny są też bardzo dobrym

wskaźnikiem prawidłowości prowadzonych procesów uzdatniania wody, takich jak

koagulacja, sedymentacja i filtracja.

Przetrwalniki tych bakterii, a wraz z nimi również cysty pasożytniczych pierwotniaków

(Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia) powinny być wyeliminowane właśnie w tych

etapach uzdatniania wody, gdyż są one bardzo oporne na działanie środków

dezynfekcyjnych. Wykrycie bakterii z rodzaju Clostridium jest technicznie znacznie

bardziej proste od poszukiwania pierwotniaków pasożytniczych i daje dużą pewność,

że woda uzdatniona jest wolna od pierwotniaków i jaj robaków chorobotwórczych

(helmintów).

Gronkowce

Gronkowce wykorzystywane są głównie przy ocenie jakości sanitarnej kąpielisk.

Kąpieliska bowiem są przyczyną szeregu zakażeń związanych z infekcjami dróg

oddechowych, skóry i oczu. W tym przypadku analiza oparta o standardowe indykatory

(Escherichia coli) jest niewystarczająca.

Często spotykane infekcje skóry powodowane są przez Staphylococcus aureus. W związku

z tym, że obecność tego mikroorganizmu w wodzie wynika z aktywności człowieka, został

on wybrany jako wskaźnikowy dla kąpielisk.

Pseudomonas aeruginosa

Obok wymienionych elementów analizy sanitarnej proponuje się obecnie dodatkowo

wykrywanie bakterii z gatunku Pseudomonas aeruginosa w wodzie do picia i na potrzeby

gospodarcze a także w wodzie dla zakładów kąpielowych oraz w wodach powierzchniowych. Przedstawicieli tego gatunku wyizolowano z kału ludzkiego oraz

w przypadkach zakażeń organizmu – z dróg moczowych, ucha środkowego, ropiejących

ran itp. Bakterie te stanowią potencjalny czynnik chorobotwórczy dla ludzi i zwierząt. Poza tym występują one powszechnie w wodach powierzchniowych i glebie. Warto także podkreślić, że mogą one bytować w chlorowanej wodzie, gdyż odznaczają się znaczną odpornością na zabiegi dezynfekcyjne.

Ogólna liczebność bakterii

W badaniach rutynowych określa się również ogólną liczbę bakterii (liczbę jednostek

tworzących kolonie, w skrócie jtk. lub cfu, z ang. colony forming units) obecnych w 1 ml

wody, po wykonaniu posiewu próbki na agar odżywczy i inkubacji w temperaturach 22oC

przez 72 godz. (psychrofile), oraz w 37oC przez 24 godz. (mezofile).

Ogólna liczebność bakterii psychrofilnych

W niższej temperaturze rosną przede wszystkim nie chorobotwórcze bakterie wodne.

Należy jednak mieć na uwadze fakt, że Gram-ujemne bakterie wodne wytwarzają

lipopolisachardy ściany komórkowej mogące działać toksycznie – tak jak endotoksyny

bakterii chorobotwórczych. Z tego powodu ich liczba powinna być także monitorowana.

Ponadnormatywny wzrost ich liczebności świadczyć może między innymi, o obecności

w wodzie łatwo przyswajalnych związków organicznych. Teoretycznie, obecność w wodzie

0,1 mg węgla organicznego może spowodować wzrost liczby bakterii w 1 ml do 108 jtk

jednostek tworzących kolonie – (ang. cfu). Również fosfor jest czynnikiem stymulującym

wzrost drobnoustrojów. Dodanie niewielkiej ilości tego pierwiastka (<50mg/l) powoduje

nawet 10-krotne przyspieszanie rozwoju bakterii w wodociągach.

Ogólna liczebność bakterii mezofilnych

Ze względów zdrowotnych, bardziej niebezpieczna jest ponadnormatywna liczba bakterii

rosnących w temperaturze 37oC, ponieważ mogą wśród nich być również bakterie

chorobotwórcze. Duża ich liczba w badanej próbce wody, może świadczyć, między innymi, o źle przebiegających procesach uzdatniania lub zasysaniu zanieczyszczonej wody. Zwiększenie ogólnej liczby bakterii obecnych w próbce wody może świadczyć także

o namnażaniu się drobnoustrojów na wewnętrznych powierzchniach instalacji wodnych, szczególnie na złączach rur i uszczelkach oraz tworzeniu się warstwy tzw. biofilmu.

Przekroczenie dopuszczanego poziomu ogólnej liczby bakterii powinno być zawsze

sygnałem do znalezienia przyczyny zanieczyszczenia i do podjęcia odpowiedniego

postępowania. Niekiedy może istnieć konieczność dodatkowego chlorowania, np. wody do

picia, powyżej 0,2 mg Cl2/l. W niektórych przypadkach dopiero zmiany konstrukcyjne

sieci wodociągowej i usunięcie biofilmu są w stanie skutecznie zabezpieczyć odbiorcę

przed wzrostem liczebności drobnoustrojów w wodzie.

Kryteria jakości sanitarnej wody do picia w Polsce.

Jakość bakteriologiczna wody do picia w Polsce oceniana jest na podstawie liczebności dwóch grup bakterii wskaźnikowych: Escherichia coli i enterokoków (tabela 1). Dodatkowo dokonuje się analizy bakterii z grupy coli oraz klostridiów redukujących siarczyny (tabela 2).Według stosowanych w Polsce kryteriów w 100 ml wody podawanej do sieci wodociągowej nie może być ani jednej komórki bakterii uznanych za wskaźnikowe. Podobne normy jakości wody obowiązują w Unii Europejskiej. Dodatkowym ważnym kryterium jakości wody do picia jest także ogólna liczebność bakterii psychrofilnych i mezofilnych w 1 ml wody. Według stosowanych w Polsce kryteriów w wodzie do spożycia przez ludzi liczebność bakterii psychrofilnych nie powinna przekraczać 100 komórek w 1ml, natomiast bakterii mezofilnych 50 komórek w 1 ml wody (tabela 2).

Osobne wymagania dotyczą wód wprowadzanych do jednostkowych opakowań (tabela 3) oraz wód w cysternach, zbiornikach magazynujących wodę w środkach transportu lądowego, powietrznego lub wodnego (tabela 4). Jakość wody ciepłej ocenia się na podstawie liczebności bakterii z rodzaju Legionella (tabela 5).


  1. Mikroflora autochtoniczna i zymogeniczna w glebie

Mikroflora autochtoniczna

Mikroflorę gleby dzieli się na autochtoniczną i zymogeniczną. Drobnoustroje autochtoniczne czerpią energię z rozkładu materii organicznej powodując jej mineralizację. Przedstawicielami tej grupy w glebie są najczęściej drobnoustroje, dla których źródło węgla i energii stanowią substancje humusowe, tj. związki powstałe z rozkładu i przetworzenia materii organicznej pochodzenia roślinnego i zwierzęcego. Przedstawicielami tej grupy są najczęściej tlenowe nieprzetrwalnikujące bakterie z rodzaju Arthrobacter oraz prątki z rodzaju Mycobacterium. Stałymi mieszkańcami gleby są także promieniowce z rodzaju Streptomyces i Nocardia oraz bakterie śluzowe (Myxobacteriales). Dla gleby, choć nie tylko dla niej, charakterystyczne są bakterie wiążące azot atmosferyczny, bakterie nitryfikacyjne. Pospolite są także tlenowe laseczki przetrwalnikujące z rodzaju Bacillus i beztlenowe z rodzaju Clostridium.

Mikroflora zymogeniczna

Drobnoustroje zymogeniczne wprowadzane są do gleb okresowo. Pochodzą one z wprowadzanych do gleb ścieków, odpadów komunalnych i przemysłowych oraz z odpadów powstających w hodowli zwierząt (np.obornik i gnojówka), Są to organizmy o dużych wymaganiach odżywczych, których rozwój uzależniony jest od dopływu świeżej, łatwo przyswajalnej materii organicznej. Bakterie zymogeniczne bytujące w glebie to głównie gramujemne pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae oraz z rodzaju Pseudomonas, Achromobacter, Flavobacterium.

W glebie zanieczyszczonej odchodami czy szczątkami zwierząt i roślin mogą występować drobnoustroje chorobotwórcze (patogenne). Spośród bakterii szczególnie niebezpieczne dla człowieka są pałeczki duru brzusznego z rodzaju Salmonella i pałeczki czerwonki – Shigella., beztlenowe laseczki wywołujące tężec – Clostridium tetani, zgorzel gazową – Clostridium perfringens, zatrucia pokarmowe – Clostridium botulinum oraz tlenowe laseczki wąglika – Bacillus anthracis, a także prątki – Mycobacterium tuberculosis.

Ponadto do bakterii chorobotwórczych występujących w glebie zalicza się niektóre promieniowce wywołujące tzw. promienicę. Grzyby są przyczyną zakażeń skóry i tkanek wewnętrznych, a organizmy zwierzęce jak pierwotniaki i robaki – chorób głównie przewodu pokarmowego. Szczególną uwagę należy zwrócić na możliwość występowania w glebie jaj robaków pasożytniczych np. glisty ludzkiej. Jej jaja przechodzą w glebie okres dojrzewania i wykazują dużą odporność na działanie czynników zewnętrznych. Podobnie jak endospory bakterii, zarodniki grzybów i cysty pierwotniaków, mogą przez długi okres czasu bytować w glebie i stanowić zagrożenie dla człowieka.


  1. Od czego zależy przeżywalność mikroorganizmów w glebie

Przeżywalność mikroorganizmów zależy od czynników fizycznych i chemicznych:

  • zawartości w glebie wody,

  • ciśnienia osmotycznego,

  • potencjału oksydacyjno redukcyjnego,

  • ph gleby,

  • temperatury,

  • natlenienia,

  • zawartości składników pokarmowych,

  • związków toksycznych,

  • światła.

Woda

Wszystkie drobnoustroje wymagają dla prawidłowego rozwoju środowiska

zawierającego wodę.

Woda umożliwia migracje mikroorganizmów w gruncie, dyfuzję substratu i związków odżywczych do wnętrza komórki oraz usunięcie z niej produktów metabolizmu. Wpływa jednocześnie na utrzymanie w komórce odpowiedniego ciśnienia osmotycznego i odczynu.

Zarówno zbyt duże zagęszczenie składników odżywczych, jak i nadmierne uwodnienie hamuje lub w ogóle uniemożliwia wzrost mikroorganizmów.

Nadmiar wody w glebie obniża dyfuzję tlenu i azotu oraz sprzyja rozwojowi drapieżników żywiących się bakteriami. Zbyt mała ilość wody może uniemożliwić

drapieżnym pierwotniakom przemieszczanie się, a przez to sprzyjać rozwojowi

populacji bakterii.

Ciśnienie osmotyczne

Na rozwój drobnoustrojów duży wpływ wywiera ciśnienie osmotyczne roztworu

glebowego związane ściśle z nawilgoceniem gleby, zwiększające się w miarę jej

przesychania.

W glebach średnio wilgotnych niezasobnych ciśnienie roztworu waha się w granicach

0,5 -5 atm. W glebach zasolonych może dochodzić do 100 atm. W komórkach

drobnoustrojów wynosi ono 3-6 atm.

Ciśnienie osmotyczne wyższe w roztworze glebowym niż w komórkach, zakłóca

proces wchłaniania wody przez komórki drobnoustrojów, co wpływa na zahamowanie

ich wzrostu.

Potencjał oksydacyjno-redukcyjny

Potencjał oksydacyjno-redukcyjny odzwierciedla tendencję substancji do pozyskiwania lub utraty elektronów. Ma on istotne znaczenie dla przebiegu zjawisk chemicznych i biologicznych w glebie.

W roztworach glebowych rozpuszczają się sole pierwiastków o zmiennej wartościowości np. Fe, Mn, S. Od stosunku utlenionych i zredukowanych związków tych pierwiastków (Fe3+/Fe2+, MnO2/Mn2+, SO42-/S2-), a także od zaopatrzenia gleby w tlen, zależą procesy tlenowe i beztlenowe w glebie.

Pierwiastki w formie utlenionej lub zredukowanej tworzą układy red-ox, od których z kolei zależy kierunek i charakter przemian metabolicznych.

Na skutek procesów dysocjacji, woda gleby ma wpływ na wartość potencjału red-ox, co z kolei oddziałuje wybiórczo na rozwój i skład drobnoustrojów glebowych.

Przesuszenie gleby i związane z tym lepsze napowietrzenie, wzmaga procesy utleniania i mineralizacji.

Przeciwnie, nadmierne jej nawilgocenie powoduje brak tlenu, przez co środowisko opanowują mikroaerofile i beztlenowce; obniżają one potencjał re-dox gleby, co stymuluje procesy redukcji i fermentacji.

pH gleby

Przebieg procesów mikrobiologicznych w glebie zależy w dużej mierze od jej odczynu, warunkuje on, bowiem aktywność enzymów oraz procesy transportu.

Roztwór glebowy odznacza się właściwościami buforowymi, czyli zdolnością przeciwstawiania się zmianom odczynu; jednakże w ograniczonym zakresie.

Odczyn gleby wpływa na rozpuszczalność i przyswajalność składników pokarmowych. Żelazo i mangan są dostępne tylko w warunkach niskiego odczynu, natomiast molibden w wysokim pH.

Wartość pH gleby zależy od jej składu chemicznego, ale w czasie procesu biologicznego rozkładu materii organicznej mogą zachodzić zmiany pH wynikające z charakteru metabolizmu i fizjologii drobnoustrojów.

Kwasowość gleby może się zwiększać pod wpływem np. kwaśnych deszczów, nawożenia, zasiedlania bakteriami utleniającymi siarkę itp., a to wpływa na przebieg szeregu transformacji metabolicznych.

Jedną z najbardziej wrażliwych na pH reakcji w glebie jest nitryfikacja, czyli przemiana NH4+ do NO3-. Jony te istotnie też wpływają na pH gleby. Pobieranie przez drobnoustroje jonów amonowych (NH4+) ze środowiska przyczynia się do zakwaszenia gleby, natomiast przyswajanie azotanów (NO3-) - do jej alkalizacji. Te z kolei zmiany wpływają na rozpuszczalność innych soli i ich przyswajalność- przez mikroorganizmy.

Wiele spośród znanych gatunków bakterii może rozwijać się w zakresie pH od 4 do 9. Optymalne dla bakterii warunki wzrostu istnieją przy pH 6,5 do 8,0.

Drobnoustroje kwasolubne mogą rosnąć w zakresie pH od 1 do 6, ekstremalne acidofile rosną chętnie przy wartościach od 1 do 3. Wśród nich są niektóre gatunki Thiobacillus, Thermophilus i Sulfolobus, utleniające siarczki mineralne do kwasu siarkowego.

Większość grzybów preferuje kwaśny odczyn środowiska. Grzyby jako grupa są

umiarkowanymi acidofilami (optymalne dla wzrostu pH wynosi od 4 do 6).

Do umiarkowanych drobnoustrojów zasadolubnych (alkalofilów) należą bakterie z rodzaju Nitrosomonas - optymalne pH ich aktywności waha się od 7,3 do 9,6.

Temperatura

Mikroorganizmy glebowe różnią się termotolerancją; różne są optymalne temperatury

rozwoju. Uwzględniając wrażliwość drobnoustrojów na temperaturę można wśród nich

wyróżnić:

- psychrofile

- mezofile

- termofile

Dla psychrofili temperatury wzrostu obejmują zakres od minus 5 do +25oC, dla

mezofili 15–45oC, dla termofili 40–70oC.

Mimo, że pojedyncze gatunki mogą mieć szerszy lub węższy zakres tolerancji na

temperaturę, to jednak większość gatunków należy do mezofili i toleruje temperaturę

około 30oC.

Organizmy rosnące w niskich temperaturach w pobliżu 0oC zawierają w błonie

komórkowej specyficzne lipidy utrzymujące jej półpłynność. Termofile zaś zawierają

lipidy, których punkt topnienia jest wysoki.

Nadmierny wzrost temperatury powoduje poważne obniżenie efektywności procesu

biosyntezy na skutek zwiększonego zużycia źródła energii na oddychanie, spadku

wydajności produkcji, powstawania skutków ubocznych. Poniżej 6oC drobnoustroje

ograniczają procesy życiowe przechodząc w stan życia utajonego (anabiozy) bądź

w formy przetrwalne.

W glebie temperatura na powierzchni może osiągać w południe nawet 70oC i

wykazywać dobową fluktuację ok.50o C. Zmiany temperatury na powierzchni w ciągu

doby nie mają wpływu na temperaturę w głębszych poziomach profilu glebowego.

Natlenienie

Tlen należy do kluczowych czynników kształtujących warunki rozwoju

drobnoustrojów, decyduje o możliwości występowania lub braku ich wzrostu, wpływa

na szybkość wzrostu i przyrost biomasy oraz na fizjologię komórek, a więc na rodzaj,

wydajność i szybkość produkcji określonych metabolitów.

Zapotrzebowanie na tlen drobnoustrojów zależy od charakteru ich metabolizmu,

rodzaju i stężenia źródła węgla i energii, fazy rozwoju populacji i stanu fizjologicznego

komórek. Tylko bakterie mogą przeżywać dłuższy okres czasu w warunkach

beztlenowych.

Tlen zawarty w glebie zużywany jest w 70% przez drobnoustroje, a w 30% przez

korzenie roślin, natomiast procesy chemiczne wykorzystują tylko śladowe ilości tlenu.

Warunki beztlenowe występują w glebach, w których zawartość tlenu w powietrzu

glebowym jest niższa od 1%.

Jeżeli niemożliwe jest dostarczenie do gleby tlenu, proces biologicznego rozkładu materii organicznej prowadzony jest przez bakterie beztlenowe, wykorzystujące do procesów utleniania komórkowego tlen pochodzący z takich związków, jak siarczany lub azotany. W warunkach beztlenowych procesy dekompozycji materii organicznej zachodzą wolniej i są mniej wydajne energetycznie.

Zawartość składników pokarmowych

Do budowy biomasy mikroorganizmów obok związków węgla niezbędne są także

inne składniki pokarmowe takie jak: azot, fosfor, siarka, wapń, magnez czy potas.

Do szczególnie ważnych pierwiastków należą azot i fosfor będące pierwiastkami

niezbędnymi do produkcji białek i kwasów nukleinowych.

Żyzne gleby zawierają wszystkie niezbędne składniki w odpowiednich ilościach

natomiast w glebach zanieczyszczonych proporcje między poszczególnymi

pierwiastkami są zakłócone. Powszechnie uważa się, że stosunek wagowy węgla do

azotu i fosforu w glebie powinien kształtować się na poziomie 10:1:0,1

Wapń poprawia właściwości fizyczne i chemiczne gleby oraz jej strukturę.

Związki toksyczne

Obecność związków toksycznych jest czynnikiem opóźniającym bądź całkowicie

hamującym procesy mikrobiologiczne w glebie.

Do szczególnie toksycznych związków należą pestycydy, węglowodory alifatyczne

i aromatyczne, formaldehyd, związki chloroorganiczne, metale ciężkie oraz sole

występujące w dużych stężeniach.

Światło

Światło penetruje zaledwie kilka cm w głąb ziemi.

Intensywność naświetlenia powierzchni gleby zależy od rodzaju i zagęszczenia

rosnących na niej roślin.

Światło jest niezbędne jedynie dla przeprowadzających proces fotosyntezy glonów

zasiedlających glebę.

Naświetlenie ma wpływ na aktywność dżdżownic – przemieszczają się one na powierzchnię gleby w nocy w poszukiwaniu żywności i w celach rozrodczych.

  1. Drobnoustroje występujące w glebie

W glebie zanieczyszczonej odchodami czy szczątkami zwierząt i roślin mogą występować drobnoustroje chorobotwórcze (patogenne). Spośród bakterii szczególnie niebezpieczne dla człowieka są:

  • pałeczki duru brzusznego z rodzaju Salmonella

  • pałeczki czerwonki – Shigella.,

  • beztlenowe laseczki wywołujące tężec – Clostridium tetani,

  • zgorzel gazową – Clostridium perfringens,

  • zatrucia pokarmowe – Clostridium botulinum

  • oraz tlenowe laseczki wąglika – Bacillus anthracis,

  • a także prątki – Mycobacterium tuberculosis.

Ponadto do bakterii chorobotwórczych występujących w glebie zalicza się niektóre promieniowce wywołujące tzw. promienicę. Grzyby są przyczyną zakażeń skóry i tkanek wewnętrznych, a organizmy zwierzęce jak pierwotniaki i robaki – chorób głównie przewodu pokarmowego. Szczególną uwagę należy zwrócić na możliwość występowania w glebie jaj robaków pasożytniczych np. glisty ludzkiej. Jej jaja przechodzą w glebie okres dojrzewania i wykazują dużą odporność na działanie czynników zewnętrznych. Podobnie jak endospory bakterii, zarodniki grzybów i cysty pierwotniaków, mogą przez długi okres czasu bytować w glebie i stanowić zagrożenie dla człowieka.


  1. Analiza helimitologiczna i mikrobiologiczna gleby

Zakres analizy mikrobiologicznej gleby pod względem sanitarnym powinien obejmować:

  • Oznaczenie obecności w glebie bakterii chorobotwórczych z rodzaju Salmonella. W glebie przeznaczonej do celów rolniczych nie mogą się znajdować bakterie należących do tego rodzaju.

  • Badania helmintologiczne polegające na określeniu liczby żywych jaj robaków jelitowych: glisty ludzkiej (Ascaris lumbricoides), glisty psiej (Toxocara sp.), włosogłówki (Trichuris trichiura), określeniu stadium ich rozwoju oraz stopnia odporności na różne warunki mikroklimatyczne.

Stopień zanieczyszczenia gleby jajami robaków (helmintów) określa się w odniesieniu do 100 g gleby, uznając glebę za:

    • nie zanieczyszczoną - nie wykrycie jaj,

    • słabo zanieczyszczoną - wykrycie pojedynczych jaj (1-3),

    • średnio zanieczyszczoną - wykrycie do 10 jaj,

    • silnie zanieczyszczoną - wykrycie 10 jaj i więcej

Ponadto badania uzupełnić można o oznaczenia:

  • ogólnej liczby bakterii – wykonywane na podłożu agarowym, temperatura - 280C, czas inkubacji –48 h,

  • bakterii przetrwalnikujących (sporowych) – podłoże agarowe, temperatura 280C, czas inkubacji–48 h,

  • bakterii termofilnych – podłoże agarowe, temperatura 550C, czas inkubacji–24 h.

  • liczebności bakterii wskaźnikowych:

  • pałeczek grupy coli,

  • pałeczek grupy coli typu fekalnego (termotolerancyjnych), głównie pałeczki okrężnicy (Escherichia coli),

  • laseczek Clostridium perfringens,

Określenia stosowane w analizie mikrobiologiczno-helmintologicznej gleby:

  • Miano – najmniejsza ilość badanej gleby wyrażona w gramach, w której stwierdza się jeszcze obecność badanych bakterii.

  • Bakterie grupy coli – Gram-ujemne pałeczki niewytwarzające przetrwalników, rozwijające się w warunkach względnie beztlenowych, mające zdolność fermentowania laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu w ciągu 48 h hodowania w temperaturze 35-37OC. Należą one do rodzaju Escherichia, Citrobacter i Enterobacter w obrębie rodziny Enterobacteriaceae.

  • Bakterie coli typu fekalnego (termotolerancyjne) pałeczki okrężnicy (Escherichia coli) – są to pałeczki z grupy coli, które poza wszystkimi właściwościami tej grupy (pałeczki Gram-ujemne, oksydazoujemne, niewytwarzające przetrwalników, względnie beztlenowe, fermentujące laktozę z wytworzeniem kwasu i gazu w temperaturze 370C w ciągu 48 h oraz dające charakterystyczne kolonie na pożywce Endo) mają ponadto zdolność wzrostu oraz przeprowadzania niektórych procesów biochemicznych, a w szczególności fermentowania laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu również w temperaturze 440C

  • Bakterie Clostridium perfringens – są to nieruchliwe, beztlenowe laseczki Gram-dodatnie wytwarzające otoczki i wykazujące zdolność do fermentacji glukozy, laktozy, rozkładu żelatyny, a także redukcji siarczynów do H2S.

  • Bakterie z rodzaju Salmonella chorobotwórcze pałeczki przewodu pokarmowego. Wiele gatunków bakterii tego samego rodzaju wywołuje salmonellozy, czyli zatrucia pokarmowe. Salmonella typhi wywołuje chorobę zwaną durem brzusznym.

  • Bakterie wytwarzające przetrwalniki (bakterie sporowe) – Gram-dodatnie laseczki (tlenowe i beztlenowe) wytwarzające przetrwalniki (zwane również endosporami). Należą głównie do rodzaju Bacillus i Clostridium.

  • Bakterie termofilne – to bakterie rozwijające się w wyższych temperaturach, 45-600C (optimum – 550C), głównie w oborniku i kompoście, stosowanych do nawożenia i mogą być wskaźnikiem ich obecności w glebach uprawnych.

  • Ogólna” liczba bakterii – to wskaźnik zawartości związków organicznych w glebie.

  • W końcowym etapie procesu mineralizacji, w miarę wyczerpywania się łatwo rozkładalnych źródeł pokarmowych wzrasta ilość spor bakteryjnych Stosunek ogólnej liczby bakterii do liczby bakterii sporowych – świadczy o stopniu rozkładu w glebie związków organicznych.

  • Badania helmintologiczne – służą wykrywaniu robaków jelitowych w glebie, a głównie ich jaj (tzw. jaj „geohelmintów”):

  • glisty ludzkiej (Ascaris lumbricoides),

  • glisty psiej (Toxocara sp.),

  • włosogłówki (Trichuris trichiura).

  • Stadium tworzenia się larwy w jaju i okresy zdolności życiowych robaków (helmintów) w glebie, mogą być użyte do oceny, od jak dawna gleba jest zanieczyszczona.


  1. Uzdatnianie wody:

  • sedymentacja (+)

  • obniżenie ogólnej liczby bakterii o 75-99%

  • promieniowanie słoneczne

  • flokulacja sedymentacyjna (zbijanie zanieczyszczeń w kłaczki)

  • drapieżnictwo

  • współzawodnictwo o pożywnie

  • pasożyty

  • (-)

  • rozwój form planktonowych (sinice, okrzemki, zielenice)

  • opad pyłu i mikroorganizmów

  • zanieczyszczenie przez ptactwo wodne

  • filtracja powolna (przez złoża pisaku o dużych średnicach)

  • (+) wytwarza się błona biologiczna (glony bakterie auto i heterotroficzne)

  • adsorpcja

  • wytrącanie

  • rozkład

  • kumulacja zanieczyszczeń

  • usuwanie bakterii allochtonicznych

  • (-) nadmierny rozwój glonów

  • zakwity

  • produkcja toksycznych metabolitów

  • odtlenienie zbiorników

  • koagulacja

  • siarczan glinu + wapń ->Co2, zakwit glonów (chlorella,Chlamydomans)

  • filtracja pospieszna – (przez bardzo drobny piasek)

  • (+) mało bakterii

  • cienka błona biologiczna

  • czasami konieczna inkubacja

  • (-)

  • przy dużej ilości materii organicznej rozmnaża się niepożądana mikroflora

  • duża przepuszczalność filtrów, przechodzi 60% drobnoustrojów z wody surowej

  • filtracja przez węgiel aktywny

  • (+)

  • adsorpcja zanieczyszczeń organicznych

  • biodegradacja

  • biokumulacja

  • nagromadzenie i namnażanie mikroorganizmów

  • (-)

  • przedostawanie się mikroorganizmów wtórnie do wody uzdatnionej

  • konieczność chlorowania i wtórna selekcja mikroorganizmów

  • dezynfekcja (ostatni etap)

  • ozonowanie – ozon jest najskuteczniejszym środkiem dezynfekującym, jego skuteczność zależy od czasu działania, zawartości węglanów, temperatury, zawartości związków organicznych

  • (+) wymaga znacznie mniejszych dawek niż chlor

  • utlenia substancje organiczne odpowiedzialne za problemy z zapachem, smakiem i barwa wody

  • (-) produkty uboczne ozonowania są niebezpieczne dla zdrowia

  • w czasie ozonowania powstają związki łatwo asymilowane przez bakterie

  • związki nietoksyczne mogą stać się toksyczne

  • po ozonowaniu trzeba zastosować jeszcze jakiś środek dezynfekujący

  • chlorowanie

  • może prowadzić do tworzenia szkodliwych produktów ubocznych

  • kwas podchlorawy wchodzi w reakcje ze związkami i powoduje, że są szkodliwe (THM – związki rakotwórcze)

Alternatywne metody dezynfekcji:

  • filtracja

  • temperatura – autoklaw

  • ultradźwięk

  • ultrafiolet

  • dimeryzacja


  1. Naturalne metody oczyszczania ścieków.

Wyróżnia się trzy zasadnicze metody oczyszczania ścieków : mechaniczne, chemiczne i biologiczne. W konkretnej oczyszczalni mogą być wykorzystane wszystkie wymienione sposoby lub niektóre z nich. W oczyszczalniach biologicznych zanim ścieki zostaną poddane działaniu mikroorganizmów, są wstępnie oczyszczane na drodze mechanicznej np. na kratach, w osadnikach czy piaskownikach. Istnieją cztery stopnie oczyszczania ścieków :

I stopień - oczyszczanie mechaniczne, polegające na usuwaniu zanieczyszczeń stałych, do zawiesin opadających włącznie,

II stopień - oczyszczanie biologiczne usuwające zanieczyszczenia rozpuszczone,

III stopień - usuwanie związków biogennych (głównie soli azotu i fosforu),

IV stopień - usuwanie resztkowych zanieczyszczeń trudno rozkładalnych, tzw. związków refrakcyjnych (ten stopień oczyszczania określany jest jako odnowa wody).

W procesie biologicznego oczyszczania ścieków zachodzą następujące zjawiska:

rozkład substancji organicznych do CO2, H2O i NH3 (w zależności od pH),

nitryfikacja (utlenianie NH3 za pomocą bakterii Nitrosomonas do azotynów),

a następnie za pomocą bakterii Nitrobacter do azotanów,

denitryfikacja (przemiana azotanów do azotu gazowego N2).


Warunki, aby bakterie miały szansę się rozwijać – odpowiednie:

pH, natlenienie, dostarczenie zw. Biogennych (azot i fosfor)


Metody naturalne:

  1. oczyszczanie w gruncie

    1. pola nawadniane – ścieki wykorzystywane są do celów rolniczych, plon zwiększa się o ok. 20 %, roczna dawka – nie więcej niż 600 mm/ar.

    2. Pola irygacyjne – różnica miedzy nimi a polami nawadnianymi polega na tym, że najważniejszym celem jest oczyszczenie ścieków a nie korzyści rolnicze. Dawka do 1500 mm/ar

    3. \ Filtry gruntowe – do 3000 mm/ar, nie wykorzystuje się tych pól do celów rolniczych

Bakterie i substancje organiczne zatrzymują się na gruzełkach i oczyszczone ścieki filtrują niżej.


  1. stawy ściekowe – zbiorniki ziemne (najczęściej zwykłe stawy). Stawy są dużo bardziej wrażliwe na obciążenie ściekami. Przy większych obciążeniach można stosować natlenianie. Najczęściej łączy się kilka stawów ze sobą:

      • bakteryjny

      • glonowy

      • skorupiakowy

  2. oczyszczanie hydrobotaniczne (fitoremediacja)

        • w ekosystemach podmokłych, bagiennych

        • mikroorg. rozkładają materię organiczną

rośliny przyswajają produkty rozkładu i tworzą swoją biomasę (trzcina, pałka)

Dobór roślin – stosunkowo szybko rosnące, dające dużą biomasę, ma zdolność

akumulacji, mało podatna na działanie szkodników.

Od czego zależy takie oczyszczanie:

      • warunki meteorologiczne

      • stężenie zanieczyszczeń

      • pH, substancje biogenne

      • wiek plantacji

      • skład roślin zastosowanycj

Zadania oczyszczania hydrobotanicznego:

      • rozkład substancji organicznej

      • usuwanie azotu

      • usuwanie fosforu

      • usuwanie pasożytów, bakterii, wirusów

(proc. sanitacji ścieków)

3 rodzaje oczyszczania hydrobotanicznego:

      • gruntowo – roślinne - ścieki spływają przez system korzeniowy

      • zbiorniki płytkie z roślinnością bagienną

      • zbiorniki z roślinnością pływającą po powierzchni


  1. Sztuczne metody oczyszczania ścieków- wykorzystują procesy samooczyszczania zachodzące w naturze ze zwielokrotnioną intensywnością

Złoża biologiczne

Oczyszczanie ścieków na złożach biologicznych odbywa się w zbiornikach wypełnionych

luźno usypanym materiałem ziarnistym i porowatym). Ścieki za pomocą zraszaczy są rozpryskiwane na górną powierzchnię złoża i spływają następnie przez wypełniający go materiał. Na materiale stałym, z którego zbudowane jest złoże wytwarza się błona biologiczna stanowiąca śluzowatą warstewkę złożoną z mikroorganizmów takich jak: bakterie (głównie bakterie tlenowe), pierwotniaki, grzyby. Złoże stałe to gruboziarnisty materiał porowaty: tłuczeń, koks, żużel wielkopiecowy, tuf wulkaniczny, tworzywa sztuczne i inne materiały odporne na wpływy atmosferyczne. Biomasa, która bierze udział w procesie rozkładu związków organicznych jest biomasą osiadłą na podtrzymującym materiale porowatym. Praca złoża polega na stałym doprowadzaniu ścieków i ich przepływie przez złoże w kontakcie z błoną biologiczną, podczas którego zachodzi mineralizacja zanieczyszczeń

na skutek tlenowego rozkładu przez mikroorganizmy i odpływ ze złoża oczyszczonego ścieku. Błona biologiczna jest początkowo utworzona z bakterii zooglealnych produkujących śluzowate otoczki. Z czasem skład gatunkowy błony zmienia się w wyniku sukcesji. Obok bakterii pojawiają się grzyby, pierwotniaki, wrotki, pierścienice i larwy much. Procesy życiowe mikroorganizmów są uzależnione od dopływu tlenu, a skuteczność rozkładu biologicznego w błonie zależy od szybkości odprowadzania, ditlenku węgla jako produktu rozkładu.

Realizacja sprawnego procesu polega na:

zapewnieniu kontaktu ścieków z błoną biologiczną,

zapewnieniu odpowiedniego napowietrzenia.

W zależności od obciążenia ładunkiem organicznym wyróżniamy następujące rodzaje złóż

biologicznych:

Niskoobciążone (nitryfikacyjne) – mogą być wypełnione materiałem naturalnym lub sztucznym. Ładunek organiczny doprowadzany na złoże jest mniejszy od 0,4 kg BZT5/m3·d. W złożach zraszanych błona jest dobrze rozwinięta i proces biologicznego rozkładu jest prawie zupełny. W końcowej fazie oczyszczania zachodzą intensywne procesy nitryfikacji, które powodują wzrost zawartości azotanów w odpływie kierowanym do osadników wtórnych (osadnik wtórny jest to urządzenie wykorzystujące proces sedymentacji, w celu oddzielenia osadu czynnego od ścieków oczyszczonych).

Średnioobciążone - wypełnione materiałem naturalno-syntetycznym, pracują przy obciążeniu objętości ładunkiem w granicach 0,4-0,65 kg BZT5/m3·d. Często stosowana jest w tych złożach recyrkulacja części ścieków oczyszczonych w celu zapewnienia odpowiedniej intensywności zraszania złoża i zapewnienia odpowiedniego stężenia ścieków doprowadzanych. Redukcja związków organicznych na tych złożach jest zadawalająca, a procesy nitryfikacji przebiegają częściowo. Nie jest konieczne wprowadzanie dodatkowych procesów oczyszczania.

Wysokoobciążone (spłukiwane) – są wypełnione materiałem naturalnosyntetycznym, obciążenie objętości złoża ładunkiem wynosi: 0,65-1,6 kg BZT5/m3·d. W złożach spłukiwanych intensywność przepływu ścieków jest większa, lecz słabiej rozwija się błona biologiczna złożona tu prawie wyłącznie z bakterii. Przepływająca ciecz wypłukuje ze złoża zużyty i martwy materiał biologiczny, wypłukiwany materiał unoszony jest w postaci kłaczkowatego osadu. Na tego typu złożach, zachodzi jedynie częściowa mineralizacja związków organicznych a proces nitryfikacji jest tu hamowany. O częściowej mineralizacji związków organicznych świadczy niska zawartość azotanów w odpływie ze złóż. W systemach złożonych, po tego rodzaju złożach, stosuje się

Osad czynny – jest także jedną z metod sztucznych opirea się na metodzie naturalnej (ulepszone stawy ściekowe


  1. Biologiczne oczyszczanie ścieków – osad czynny.

Osad czynny jest metodą oczyszczania, w której elementem oczyszczającym są bakterie zlepione w kłaczki zawieszone w środowisku płynnym (ścieki). Kłaczki osadu powstają podobnie jak błona biologiczna, w wyniku łączenia się bakterii zooglealnych wytwarzających lepki śluz. Proces tworzenia się kłaczków, zwany flokulacją, zachodzi spontanicznie w trakcie napowietrzania komory wypełnionej ściekami.

W oczyszczalniach pracujących metodą osadu czynnego ścieki, po oczyszczaniu mechanicznym w osadniku wstępnym, są kierowane do komory osadu czynnego, zwanej też komorą napowietrzania, gdzie odbywa się właściwe oczyszczanie biologiczne. Kłaczki osadu wchodzą tu w kontakt ze ściekami w warunkach sztucznego napowietrzania i intensywnego mieszania. Bakterie obecne w kłaczkach pochłaniają substancję organiczną ze ścieków i część jej zużywają jako paliwo (źródło energii), część natomiast przyswajają jako materię bu dulcową, co prowadzi do zwiększenia biomasy. Efektem tych procesów jest mineralizacja ścieków i wzrost masy osadu czynnego.

Wykorzystanie zanieczyszczeń przez bakterie osadu czynnego.


Po kilku godzinach przetrzymywania ścieków w komorze, są one przepuszczane do osadnika wtórnego, w którym zachodzi oddzielenie kłaczków od oczyszczonych ścieków. Kłaczki osadzają się na dnie osadnika i są recyrkulowane albo z powrotem do komory napowietrzania, by utrzymać stężenie biomasy (osad powrotny), albo do osadnika wstępnego i wraz z osadem wstępnym usuwane z obiegu oraz unieszkodliwiane (osad nadmierny). Układ technologiczny procesu osadu czynnego przedstawia rysunek:

Układ oczyszczalni ścieków z osadem czynnym:

1 - osadnik wstępny, 2 - komora osadu czynnego, 3 - osadnik wtórny, 4 - stacja pomp osadowych, Qść - ścieki, Qn - osad nadmierny, Qr - osad powrotny

Jako, że elementem oczyszczającym w tej metodzie są kłaczki zlepionych bakterii, dlatego ważne jest, aby proces flokulacji przebiegał prawidłowo i aby powstałe kłaczki miały odpowiednią wielkość, kształt i strukturę. Flokulacja zależy od stopnia obciążenia osadu ładunkiem zanieczyszczeń. Przy bardzo wysokim i bardzo niskim obciążeniu obserwuje się bowiem zjawisko deflokulacji, czyli rozpraszania się bakterii skupionych w kłaczki. Gdy osad jest nadmiernie obciążony, kłaczki są nie dotlenione, natomiast w przypadku niedociążenia bakterie giną z braku pokarmu.

Wielkość kłaczków jest istotną cechą wpływającą na efektywność oczyszczania. Zależą od niej dwa ważne procesy: biosorpcja (pochłanianie zanieczyszczeń ) i sedymentacja (opadanie kłaczków). Biosorpcja jest etapem poprzedzającym biodegradację i zależy od wielkości powierzchni kłaczków. Powierzchnia ta jest tym większa, im kłaczki są mniejsze. Jednak zbyt małe kłaczki, choć mają dużą powierzchnię sorpcyjną, źle opadają w osadniku wtórnym. Może to prowadzić do wtórnego zanieczyszczenia odbiornika, do którego odprowadza się oczyszczone, ale nie oddzielone od kłaczków ścieki. Natomiast kłaczki zbyt duże, choć świetnie sedymentują, to jednocześnie słabo oczyszczają ścieki. Wynika to z faktu, że bakterie umieszczone w centralnej części dużego kłaczka mają utrudniony dostęp do tlenu i zanieczyszczeń będących substratem pokarmowym. Kłaczki muszą więc wykazywać właściwy stan rozdrobnienia zapewniający odpowiednie warunki tlenowe i pokarmowe.

Kształt kłaczków jest cechą, która może wskazywać na pewne niekorzystne zjawiska w osadzie. Np. kształt gwiaździsty, pierzasty czy siatkowaty wiążą się zwykle z obecnością mikroorganizmów nitkowatych (głównie bakterii i grzybów), których obecność w osadzie jest niepożądana, gdyż powodują jego puchnięcie.

Struktura kłaczka może być spoista bądź luźna. W warunkach niedotlenienia lub braku pokarmu kłaczki przybierają formę zbitych, obłonionych tworów koloru szarego. Obecność takich kłaczków w osadzie powoduje spadek jego aktywności. Wiele różnych czynników powoduje rozluźnienie kłaczków. Należą do nich: rozwój form nitkowatych, nadmiar lub niedostatek tlenu, przeciążenie osadu lub warunki głodowe.

Niekorzystnym zjawiskiem obniżającym zdolności sedymentacyjne kłaczków jest puchnięcie osadu czynnego. Z puchnięciem mamy do czynienia, gdy zwiększa się objętość osadu przy zachowaniu tej samej masy. Liczbowo wyraża to indeks osadu, który przedstawia objętość (w cm3) jednego grama jego suchej masy. Indeks wyraża więc gęstość osadu, lub stopień uwodnienia. Jeden gram suchej masy dobrze pracującego osadu czynnego ma zwykle objętość 67 cm3 (indeks = 67 cm3/g). Indeks osadu spuchniętego mieści się w granicach od 100 - 400 cm3/g. Spuchnięty osad jest co prawda bardzo aktywny (duża powierzchnia biosorpcyjna), jednak z powodu obniżonej opadalności nie może być on oddzielony od oczyszczonych ścieków w osadniku wtórnym . Wiele jest przyczyn puchnięcia osadu. Bezpośrednią przyczyną tego zjawiska mogą być organizmy nitkowate, bakterie zooglealne, rozproszenie kłaczków lub wzrost lekkości osadu spowodowany wydzielaniem się pęcherzyków gazu. Organizmy nitkowate (głównie bakterie i grzyby) wywołują tzw. puchnięcie włókniste. Zwykle dochodzi do niego, gdy skład ścieków jest niewłaściwy (zbyt duże ilości węglowodanów w stosunku do azotu i fosforu), w sytuacji przeciążenia osadu, nagłych zmian obciążenia , niedotlenienia, zakwaszenia, zatrucia, obniżenia temperatury lub niedostatecznie długiego przetrzymywania osadu w komorze napowietrzania. Do najczęściej spotykanych mikroorganizmów nitkowatych należą bakterie: Sphaerotilus, Beggiatoa i promieniowce. Mniej poznanym zjawiskiem jest puchnięcie niewłókniste. Wywołane jest ono nadmierną produkcją pozakomórkowych substancji śluzowych przez pewne bakterie zooglealne. Śluzy te wiążą bardzo dużo wody, co sprawia, że osad jest czterokrotnie silniej uwodniony niż w przypadku spuchnięcia włóknistego. Zwiększenie indeksu osadu może też spowodować rozproszenie kłaczków w wyniku zbyt silnej turbulencji w komorze lub też wynoszenie osadu w osadniku wtórnym. Z tym drugim przypadkiem mamy do czynienia, gdy osad jest zbyt długo przetrzymywany w osadniku i dochodzi do rozwoju beztlenowych bakterii denitryfikacyjnych wydzielających pęcherzyki azotu cząsteczkowego.

Bakterie tworzące kłaczki nie są jedynymi organizmami występującymi w osadzie czynnym. Oprócz bakterii występują tu liczne pierwotniaki i wrotki, rzadziej robaki, pierścienice i grzyby. Biocenoza osadu czynnego ma charakter heterotroficzny.

Piramida przedstawiająca zależności troficzne w osadzie czynnym.

Bazą pokarmową całego zespołu organizmów jest materia organiczna dopływająca wraz ze ściekami. Pierwszy poziom troficzny tworzą bakterie heterotroficzne, grzyby i pierwotniaki saprotroficzne (korzenionóżki i wiciowce), które odżywiają się materią organiczną w postaci roztworów i zawiesin. Drugi poziom stanowią pierwotniaki holozoiczne (gr.holos - cały) odżywiające się całymi mikroorganizmami. Należą tu orzęski. Wreszcie, najwyższy poziom troficzny zajmują orzęski drapieżne (zwłaszcza osiadłe gatunki z grupy Suctoria, które zjadają pierwotniaki bakteriożerne) , a także bezkręgowce takie, jak wrotki, robaki z grupy nicieni i in. Organizmy obecne we wpracowanym osadzie czynnym tworzą zespół, który powstał w wyniku procesu sukcesji. Początkowo w ściekach obecne są głównie bakterie, wiciowce (Zooflagellata) i korzenionóżki (ameby) (Rhizopoda), a więc organizmy odżywiające się materią organiczną zawartą w ściekach. Z czasem pojawiają się orzęski (Ciliata) zjadające bakterie i drapieżne. Z orzęsków najwcześniej rozwijają się formy wolno pływające, pożerające bakterie, które nie zlepiły się jeszcze w kłaczki (nie sflokulowane). W następnym etapie, gdy proces flokulacji jest już zaawansowany, pojawiają się formy osiadłe orzęsków (przyczepione do kłaczków). W ostatnim etapie rozwijają się wrotki (Rotatoria). Opisane przemiany ilustruje wykres:

Sukcesja mikroorganizmów podczas hodowli osadu czynnego

Znajomość przemian sukcesyjnych w osadzie oraz właściwości biologicznych mikroorganizmów jest przydatna w ocenie pracy oczyszczalni. Służy do tego analiza mikroskopowa próbki osadu, obejmująca, oprócz opisu wyglądu kłaczków, również badanie składu mikrofauny. Stwierdzenie dużej liczebności wiciowców i ameb (korzenionóżek), a więc pierwotniaków pionierskich, świadczy o przeciążeniu osadu i jego niedotlenieniu (a więc o warunkach przypominających początkowe etapy rozwoju osadu). Występowanie orzęsków natomiast, zwykle świadczy o dobrej pracy osadu. Dotyczy to zwłaszcza form osiadłych. Orzęski bakteriożerne wywierają stałą presję na populacje bakteryjne, które pobudzane są przez to do ciągłych podziałów. Wynikiem tego jest odmładzanie się flory bakteryjnej i jej zwiększona aktywność metaboliczna. Poza tym orzęski przyczyniają się do klarowania ścieków zjadając nie sflokulowane bakterie. Obecność w osadzie wrotków zwykle świadczy o dobrym natlenieniu osadu i jego stabilizacji

Na powierzchni bakteri znajdują się enzymy hydrolityczne, dzięki którym wiążą się z substratami. Bakterie mają na zewnątrz ładunek ujemny, więc łączą się wszystkie substancje o ładunku dodatnim oraz dodatkowo przyklejają się do śluzu. Powstają konglomeraty – kłaczki (FLOKULACJA – kłaczkowanie).

Najlepiej flokulują te bakterie, które wydzielają duże ilości śluzu – Zooglea ramigera; orzęski, wrotki – przez otwór gębowy wydzielają saubstancje mające charakter zlepiający.

Sposób w jaki kłaczkuje dany osad decyduje o prawidłowości prowadzenia procesu.

Ważny jest stosunek objętości do masy kłaczka.

Deflokulacja – całkowity rozpad kłaczków, za duża ilość ścieków -> całkowite zmętnienie

za mała -> autoliza

  • hodowla czynna – doprowadza się ścieki i wylewa

  • hodowla statyczna – stale doprowadza i odprowadza

Biocenoza

W ściekach gospodarczo-bytowych: Zooglea, Pseudomonas, Achromobacter, Flavobacterium - HETEROTROFY; AUTOTROFY: nitryfikatory, siarkowe

GRZYBY: puchnięcie osadu – wzrost objętości w stosunku do masy

PIERWOTNIAKI: wiciowce, orzęski, korzenionóżki – uczestniczą we flokulacji, wskaźnik dobrej pracy osadu, część oczyszcza, większość odżywia się bakteriami – klarują osad

wiciowce – 30 000 w 1 ml, skaźnik złej pracy osadu, niedobór tlenu, ścieki

zagniwające

orzęskidobra praca osadu, odżywiają się bakteriami, glonami, zw. org; 90

gatunków; do 10 000/ml

  1. o. Wolnoprływające np. pantofelek

  2. o. Pełzające po kłaczkach

  3. o. Osiadłe np. Vorticella opercularia – bardzo dobra praca osadu

- korzenionóżki – nibynóżki otaczają pokarm, czasami mają skorupę zewnętrzną;

do 50 000/ 1ml; duża ilość świadczy o niestabilności osadu

  1. nieoskorupione – świadczy o niestabilności os.

  2. oskorupione –> niewiele zw. org, dobre natlenienie, proces nitryfikacji

zachodzi dobrze

ZWIERZĘTA BEZKRĘGOWE

- wrotki osad dobrze pracuje, stabilny, dobrze natleniony; od 90% BZT;

odżywiają się bakteriami i cz. Osadu, wydalają dość duże ilości śluzu

- nicienie – max 130 w 1 ml; zjadają biomasę osadu czynnego, dotleniają kłaczka,

zwiększają powierzchnię sorpcyjną, rozdrabniają osad, jak jest ich za

dużo mogą zjeść osad, sprzyjają flokulacji.

Parametry fizyko-chemiczne decydujące o pracy osadu:

      • temperatura: 15-25 st. – optimum

      • ilość tlenu: (ograniczane przez temp.) natlenienie1-3 mgO2/litr

      • odczyn 7-7,5 – optimum; 6-9 – dopuszczalne

      • składniki odżywcze: węgiel, azot, fosfor

N:BZT5 - 1:17

P:BZT5 - 1:90

Uzupełnia się np. wodą amoniakalną

      • związki toksyczne – gł. w ściekach przemysłowych -> dezaktywacja

enzymu, zmniejszony poziom tlenu. Przyrost biomasy

          • adaptacja – dozowanie ścieków toksycznych

          • inokulacja – preparaty

      • zsedymentowany osad jest zawracany do komory natlenienia


  1. Biologiczne oczyszczanie gruntów

Bioremediacja to proces oczyszczania gruntów, w którym wykorzystywane są mikroorganizmy- rozkładają one substancje toksyczne do mniej toksycznych/całkiem nie toksycznych.

Kryteria decydujące o możliwości zastosowania bioremediacji do neutralizacji zanieczyszczeń:

  • środowisko podlegające bioremediacji powinno zawierać mikroorganizmy u których zachodzą wymagane procesy kataboliczne,

  • mikroorganizmy wykorzystywane w procesie bioremediacji powinny być zdolne do przetwarzania związków chemicznych w odpowiednim tempie i obniżać ich koncentracje do poziomu nie przekraczającego norm,

  • metabolity powstające podczas mikrobiologicznego rozkładu nie mogą posiadać właściwości toksycznych, mutagennych czy rakotwórczych,

  • środowisko podlegające bioremediacji nie może zawierać związków chemicznych działających toksycznie i inhibitująco na drobnoustroje przeprowadzające proces biodegradacji,

  • dany związek bądź związki, które mają być usunięte w procesie bioremediacji muszą być dostępne dla mikroorganizmów a więc biodegradowalne,

  • warunki w miejscu przeprowadzania procesu lub w bioreaktorze powinny sprzyjać rozwojowi i działalności drobnoustrojów np. dostateczna ilość składników pokarmowych, tlen lub inny elektronobiorca, sprzyjająca wilgotność, odpowiednia temperatura oraz dodatkowe źródło węgla w sytuacji, gdy biodegradacja ma zachodzić w oparciu o zjawisko kometabolizmu,

  • koszt technologii powinien być tańszy lub porównywalny do innych technologii dotychczas opracowanych i stosowanych.

Przeprowadzanie procesów oczyszczania gruntów:

- in situ likwidacja zanieczyszczeń bezpośrednio w miejscu ich występowania
- ex situ zanieczyszczony grunt wydobywa się i dopiero wówczas poddaje właściwym zabiegom regeneracyjnym (stosowane w przypadku, gdy gleba skażona jest szczególnie niebezpiecznymi substancjami)

Metody in situ

biostymulacji procesu biodegradacji ropopochodnych dokonuje się poprzez

-wzbogacanie gruntów w pierwiastki biogenne- nawożenie P i N, ewentualnie K (optymalny stosunek C:N:P 100:10:1)
-korektę odczynu- odkwaszanie poprzez wapnowanie

-napowietrzanie- tworzenie warunków tlenowych

-uprawienia roślin wspomagających oczyszczanie- trawy, rośliny motylkowe

głębiej zalegające zanieczyszczenia ww metody plus

  • inokulacji gruntu mikroorganizmami aktywnie rozkładającymi zanieczyszczenia

  • zabiegi przewietrzania gleby strumieniem powietrza,

  • przemywania roztworem zawierającym substancje odżywcze czy kultury aktywnych mikroorganizmów

Bioekstrakcja wymuszona infiltracji wody gruntowej (bioremediacja stymulowana wodą) z napowietrzaniem (biowentylacja) daje zwiększenie desorpcji zanieczyszczeń ropopochodnych.

Bioremediacja stymulowana wodą in situ ma na celu wymuszenie pionowego, a następnie

poziomego przepływu wody wraz z substancjami ropopochodnymi w środowisku

gruntowo-wodnym może być wspomagana obecnością

substancji powierzchniowoczynnych w środowisku gruntowo-wodnym.

Badania wykazały, że surfaktanty syntetyczne oraz biosurfaktanty mogą

przyspieszać proces biodegradacji produktów naftowych, w szczególności ciężkich

frakcji ropy naftowej.

Biowentylacja stosowana jako samodzielna technika oczyszczania prowadzona w celu maksymalizacji ulatniania się związków węglowodorowych o małej masie cząsteczkowej (np. produktów na bazie benzyny lekkiej lub rozpuszczalników)

Napowietrzanie prowadzi się w sposób bierny lub aktywny. W przypadku wentylacji biernej napowietrzanie odbywa się poprzez system rur perforowanych w sposób samoistny. Wentylacja aktywna polega na wytworzeniu podciśnienia (ekstrakcja powietrza gruntowego) lub nadciśnienia (iniekcja powietrza).

Metody ex situ

stosowane gdy istnieje niebezpieczeństwo migracji toksycznych zanieczyszczeń do wód gruntowych oraz proces detoksykacji musi być przeprowadzony w krótkim czasie.

Metoda bioreaktorowa

metoda kosztowna, przeprowadzana pod pełną i ciągłą kontrolą stosowana dla mniejszych ilości gleby
technologii opartych o metody ex situ:

  • bioreaktory

  • laguny stosowane do oczyszczanie zaolejonych ścieków

  • reaktory półpłynne stosowane dooczyszczania zanieczyszczonej gleby, szlamów i osadów

Mikroorganizmy wykorzystywane w procesie bioremediacji

Proces bioremediacji może być prowadzony w oparciu o mikroflorę autochtoniczną,

naturalnie zasiedlającą skażony grunt lub w oparciu o szczepy pochodzące z innych

środowisk bądź kolekcji odznaczające się wysoką aktywnością degradacyjną. Konieczne jest stosowanie mieszanej kultury mikroorganizmów o zróżnicowanych możliwościach metabolicznych

Dobór szczepów:

Warunkiem adaptacji inokulantów w gruncie jest brak antagonistycznych

oddziaływań z naturalną mikroflorą gleby.

Biopreparaty powinny być całkowicie bezpieczne dla człowieka i środowiska. Oznacza

to, że nie mogą to być organizmy patogenne. Poza tym ważne jest, aby metabolity

powstające w procesie rozkładu ksenobiotyków nie posiadały właściwości toksycznych,

mutagennych czy rakotwórczych

Szczepy zawarte w biopreparatach są przechowywane w formie liofilizatów, zamrażane bądź umieszczane w specjalnej zawiesinie podział preparatów ze względu na skład:

  • bakteryjne

  • enzymatyczne

  • bakteryjno-enzymatyczne

Zaszczepienie gruntu poprzedza namnożenie mikroorganizmów w specjalnie przystosowanych bioreaktorach

Bioaugmentacja

Wzbogacenie zanieczyszczonego terenu w specjalnie wyselekcjonowane, o dużej zdolności biodegradacji zanieczyszczeń, bakterie stosuje się, gdy rodzima populacja bakterii na skażonym terenie nie występuje.


  1. Klasyczna metoda identyfikacji mikroorganizmów

Taksonomia (gr. taxis - porządek) zajmuje się opisem organizmów, ich nazywaniem i klasyfikacją (porządkowaniem)

Taksonomia jest poddyscypliną systematyki – szerszej dyscypliny badającej różnorodność organizmów i związki pokrewieństwa między nimi

Taksonomia dzieli się na:

- klasyfikację,

- nomenklaturę (nazewnictwo)

- identyfikację

Rodzaje taksonomii (klasyfikacji) pożądanej aktywności w kierunku biodegradacji zanieczyszczeń.

  • Taksonomia sztuczna: - porządkuje mikroorganizmy na podstawie podobieństwa cech fenotypowych (morfologii, biochemii, serologii, fizjologii)

  • Taksonomia numeryczna - jest zobiektywizowaną formą taksonomii sztucznej i opiera się na zasadzie Adansona .

Taksonomia numeryczna opiera się na założeniu, że wszystkie uchwytne cechy organizmu są w klasyfikacji tak samo ważne (zasada Adansona)

  1. W klasyfikacji tej bierze się pod uwagę dużą liczbę cech (ponad 100) i formułuje j