Witaj ponownie!
Mail Grupowy pomaga Twojej grupie sprawnie się komunikować, dzielić notatkami, wydarzeniami i opiniami. Dowiedz się więcej »
Przedmioty Wykładowcy Uczelnie

zagadnienia


Prowadzący Ryszard Słomski
Informacja dla prowadzących
Podgląd

zagadnienia genetyczna, poprawione.docx

Podgląd pliku (pełna wersja wyższej jakości po zalogowaniu):

1. BIOTECHNOLOGIA ŻYCIA CODZIENNEGO


1. ENZYMY

Enzymy uzyskiwane dzięki inż. Genetycznej stosowane są obecnie w wielu gałęziach przemysłu. Znajdują zastosowanie przy produkcji alkoholu, chleba, piwa, chem. Domowej, soków, olejów, kosmetyków, skór, lekarstw, przetwórstwie skrobi i wyrobów tekstylnych.

A) α AMYLAZA (termamyl)

Termamyl jest płynnym preparatem enzymatycznym, zawiera termostabilną amylazę

Źródło:

Termamyl jest termostabilną amylazą wytworzoną przez zmodyfikowany genetycznie szczep Bacillus licheniformis. Samo białko nie jest modyfikowane. Przeniesienie genu do bakterii spowodowało podwyższenie produkcji tego enzymu.

α Amylaza- zastosowanie w nast. gałęziach przemysłu:

  • Skrobiowy-do upłynniania skrobi w temp od 105-110˚C co umożliwia jego niezwykła odporn. na ogrzewanie

  • Monopol-do zmniejszania ziaren skrobiowych przed przygotowaniem do destylacji

  • Browarniczy-do uzyskania skrobi płynnej

  • Cukrowniczy-do degradacji skrobi wyst. w soku trzciny cukrowej. Obniża to zawartość skrobi surowym cukrze i umożliwia lepszą filtrację cukru

  • Tekstylny-do szybkiej, wysokotemp. dekatyzacji tkanin przed barwieniem

Aktywność

Enzym jest endoglikozydazą, która hydrolizuje wiązanie 1-4 α glikozydowe w amylazie i amylopektynie-dwóch głównych skł. skrobi. Skrobia jest szybko doprowadzana do rozpuszczalnych dekstryn i oligosacharydów. Optimum pH 7.0 . Temp 90˚C. stabilny przez długi okres czasu (co najmniej rok).

B) AMYLOGLUKOZYDAZA (AMG)

AMG jest enzymem, który usuwa reszty glukozy z płynnej skrobi w powolnym procesie, kończącym się produkcją glukozy

Źródło:

AMG jest otrzymywany z wyselekcjonowanych szczepów Aspergillus niger.

Zastosowanie:

AMG stosuje się do produkcji syropu glukozowego ze skrobi lub dekstryn. Może zastępować działanie amylazy, można też wiązać z alginianem wapnia.

Aktywność

AMG hydrolizuje wiązania 1-4 i 1-6 α glikozydowe w upłynnionej skrobi. Podczas hydrolizy reszty glukozy są stopniowo uwalniane od końca nieredukcyjnego substratu. Szybkość hydrolizy zależy od dł. Łańcucha skrobiowego. Wiązania 1,4 glikozydowe są hydrolizowane wydajniej. Maltotrioza i maltoza hydrolizowane są w mniejszym stopniu. AMG posiada optimum pH 4.0; opt temp 75˚C. preparat przechowywany jest w 0-5˚C przez co najmniej rok.

C) CELULAZA( celluclast)

Celluclast jest preparatem stosowanym do degradacji celulozy(polimerów glukozowych)do glukozy, celobiozy i dłuższych polimerów glukozowych.

Źródło

Celluclast jest wytwarzany z wyselekcjonowanych szczepów grzyba Trihoderma reesei.

Zastosowanie

Celluclast jest stosowany wówczas, gdy celem jest degradacja materiałów celulozowych dla potrzeb fermentacji, dla redukcji lepkości rozpuszczalnych produktów celulozowych i do zwiększania wydajności uzyskiwania cennych produktów pochodzenia roślinnego.

Aktywność

Opt. pH 4,5-6 temp 50-60˚C. w temp 25C enzym jest aktywny przez 3miesiące, w niższych znacznie dłużej.

D) KARBOKHYDRAZY(Viscozyme)

Viscozyme jest kompleksem wielu enzymów zawierających szerokie spektrum akt. Karbohydraz. Działa też na pektyny i pektynopochodne substancję znajdujące się w ścianie kom. W laboratoriach stosowany jest do uzyskiwania protoplastów komórek roślinnych np. z sałaty

Źródło

Viscozyme jest wytwarzany przez szczep grzyba Aspergillus aculeatus

Zastosowanie

Viscozyme znalazł szerokie zastosowanie w obróbce produktów spożywczych pochodzenia roś. , uzyskiwania płatków śniadaniowych i jarzyn. Zwiększa również wydajność fermentacji skrobi poprzez degradację polisacharydów nieskrobiowych często towarzyszących skrobi. Zmniejsza lepkość mat. Roślinnych poprawia wydajność ekstrakcji. W laboratorium stosowany do degradacji tkanek np.liści, celem uzyskania protoplastów i pojedynczych komórek do obserwacji mikroskopowych

Aktywność

W skład produktu wchodzą : arabinoza, cellulaza, βglukanaza, chemicelulaza, ksylanaza. Może usuwać pektyny ze śr. Kom. Opt. pH 3,3-5,5; opt temp 3-5C enzymy zachowują aktywność przez rok

E) IZOMERAZA GLUKOZY (Sweetzyme)

Sweetzyme jest immobilizowaną izomerazą glukozy, która konwertuje D-glukozę do D-fruktozy. Sweetzyme jest stosowany bardzo szeroko na świecie do wytwarzania syropów o dużej zaw. fruktozy, wykorzystywanych w przemyśle cukierniczym i do produkcji napojów

Źródło

Sweetzyme jest uzyskiwany ze szczepów bakt. Streptomyces murinus

Zastosowanie

Produkcja syropów fruktozowych z syropów glukozowych które zwykle pochodzą z kukurydzy lub skrobi.

Aktywność

Enzym jest stabilny przez rok. Jeden kg immobilizowanego sweetzyme może konwertować, co najmniej 18000kg suchej masy syropu fruktozowego. Opt pH 7,5-7,8; opt temp 55-60C

F) INWERTAZA(Maxinvert)

Inwertaza jest głównie stos. W przemyśle spożywczym przy wyrobie czekolad z nadzieniem. Nadzienie wytwarzane jest z zastos.sacharozy. Niewielkie ilości inwertazy dodawane są do twardego nadzienia przed pokryciem czekoladą. Podczas przechowywania przez kilka tygodni w 18˚C enzym częściowo upłynnia sacharozę wewnątrz otoczki czekolady.

Została opac. Przez chem.H.S. Paine’a w 1924r.

Nowe technologie umożliwiają wypełnienie cukierków płynnym nadzieniem także z zastosowanie specjalnych urządzeń chłodzących, chroniących czekoladę przed rozpuszcz.

Źródło

Maxinvert jest wytwarzany przez drożdże piekarnicze Saccharomyces cerevisiae

Aktywność

Inwertaza zwana również sacharozą zrywa wiąz. w sacharozie uwalniając glukozę i fruktozę. Blokowana jest też przez wys. stęż.substratu-sacharozy. Opt pH4,5,zakres akt.pH 3.0-5,5. opt temp 60˚C. inwertaza jest inaktywowana przez ogrzewanie 5min w 95C, w temp 3-5C enzym jest stabilny przez co najmniej rok.

G) LAKTAZA (Lactozym)

Jest preparatem zawierającym laktazę (β- galaktozydazę), hydrolizuje dwucukier- laktozę do słabszych smakowo monosacharydów glukozy i galaktozy. Jest szeroko stosowana do produkcji nabiału np. mleka o niskiej zawartości laktozy dla kotów.

Źródło

Lactozym jest wytwarzany przez drożdże nabiałowe Klyveromyces lactis.

Zastosowanie:

- Słodkie mleko i produkty o zmniejszonej zawartości laktozy. –produkcja pożywienia dla osób nieprzyswajających laktozy, również dla kotów. – w napojach mlecznych poddanych działaniu laktazy nie jest konieczne dosładzanie mleka, ponieważ glukoza z galaktozą są słodsze od mleka - w produkcji skondensowanego mleka zapobiega krystalizacji laktozy i koagulacji - dojrzewające produkty mleczne – dodanie laktazy przyspiesza fermentację co można wykorzystać do produkcji twarogów i jogurtów. Jednocześnie produkty stają się słodsze i mogą być dłużej przechowywane. W przypadku jogurtów owocowych zbędne jest dosładzanie co umożliwia przygotowanie jogurtów o zmniejszonej kaloryczności. – zastosowanie laktazy powoduje że konsystencja lodów jest lepsza, nie tworzą się kryształy laktozy. Łatwiej można lody porcjować i nie zachodzi obawa wystąpienia problemów ze spozyciem przez osoby nie przyswajające laktozy.
Aktywność:

Działanie laktazy na laktozę prowadzi do uzyskania mieszaniny glukozy i galaktozy. Aktywność jest hamowana nadmiarem produktu reakcji- galaktozy. Optymalna aktywność przypada na pH 6,5 i temp 48°C ale w tych warunkach enzym nie jest stabilny. Przechowywany w temp 5°C zachowuje aktywność przez co najmniej 6 miesięcy.

H) PEKTYNAZY (Pectinex)

Czy można obrać owoc bez dotykania

Źródło

Pectinex jest wytwarzany przez wyselekcjonowane szczepy Aspergillus niger.

Jest mieszaniną kilku typów pektyna przeznaczonych głownie do maceracji tkanek roślinnych owoców i warzyw. Preparat można stosować do zwiększania wydajności soku z jabłek, jak również do „obierania” owoców cytrusowych.

Aktywność:

Pectinex jest mieszaniną enzymów, głównym enzymem jest pektynotranseliminaza poligalakturonowa i esteraza pektynowa. Jako aktywność dodatkową wykazuje aktywność chemicelulazy i celulazy. Opt pH 4,5 ; temp 50°C, podczas przechowywania w 10°C enzym jest stabilny przez co najmniej rok.

I) ESTERAZA PEKTYNOWA (NovoShape)

Większość pektyna to mieszanina kilku różnych pektynaz. Preparat NovoShape zawiera tylko 1 esterazę pekt., która modyf.cz. pektyn bardzo precyzyjnie, co umożliwia Zach kształtu i struktury owoców w prod.żywn

Źródło

Gen kodujący est.pekt. uzyskano z grzyba Aspergillus acculeatus który naturalnie wytwarza kilka pektyna. Gen przeniesiono do spokrewnionego szczepu Asp.oryzae

Zastosowanie

-preparat stosowany jest w żywn. Zaw. całe owoce do utrzym.kształtu struktury, jak również liczby owoców w produkcie

-enzym usuwa grupy metylowe z pektyn umożliwiając dwuwartościowym kationom np. wapnia tworzenie wiąz.między nimi. Powoduje żelatynację pektyn i wznowienie struktury.

Aktywność:

N.hydrolizuje estry metylowe kw.galakturonowego subst.pektyn. nie zawiera akt.poligalakturanozowej . akt w temp 10-60C(max pH 4,8 i temp 50C). 3-5C co najmniej rok aktywny

J) PROTEAZA (Neutrase)

N.jest bateryjną protezą wytwarzana przez wyselekcjonowany szczep Bacillus amyloliquefaciens. Degraduje białka do peptydów

Zastosowanie

Komercyjnie stosowana do ulepsz.białek pochodz. roś. i zw. W laboratoriach do izolacji DNA

Proteinaza Kizolacja DNA (szczególnie z tkanek)

Aktywność:

Neutralna proteza o opt pH 5,5-7,5 opt temp 45-55C, ulega inaktywacji poprzez ogrzewanie przez 2min w 85C. przechowywanie 3.5C zachowuje akt przez ponad rok. Jest metaloproteinazą potrzebująca jonów cynku do zachowania akt. Stabilizują ja jony wapnia i inhibuje EDTA. Niektóre białka obniżają stabilność. Ulega inaktywacji poprzez ogrzanie przez 2min (akt ponad rok 3-5C)

K) CHYMOZYNA(Maxiren) e. stosowany do produkcji serów. Jest identyczna z enz. zw. lecz otrzymywana jest z Kluyveromyces lactis

Źródło

Otrzymamy jest ze zmodyf genet. drożdży Kluyveromyces lactis

Zastosowanie

Używany do koagulacji białek mleka podczas procesu wytwarzania sera. Jego parametry i właściwości są ideat z preparatami chymozyny uzyskiwane z cieląt

Aktywność:

Indukuje koagulację przez hydrolizę wiąz. między fenyloalaniną a metioniną w kappa kazeinie. Czas koagulacji jest odwrotnie proporcj.do stężenia enzymu. Opt pH 6,6 i temp 42,5C a dla mleka pasteryzowanego pH 6,5 i temp 45C. chymozyna jest nieaktywna w temp przekraczającej 55C i niższej niż 15C. preparat należy przechowywać w temp 3-5C

L) PODPUSZCZKA(chymozyna) grzybów(Fromase)

Proteza wytwarzana przez bakt.glebowe Rhizomucor miehei.

Zastosowanie

Stosowany w miejsce podpuszczki cielęcej do aglutynacji mleka przy prod.serów. posiada inną akt. niż chymozyna

Aktywność

Fromase XL- jest termostabilny, jego akt. Znacznie spada powyżej 40C i jest to bardzo przydatne w prod. Tych rodzajów serów w których ciągła aktywność enzymu powodowałaby zmiany jakości sery wielodojrzewające. F przechowywać 3-5C

2. ZASTOSOWANIE:

A) ENZYMY PROSZKÓW DO PRANIA

e. otoczkowane są aby zapobiec uwalnianiu e. do atmosfery. Podczas kontaktu z wodą granulki rozpuszczają się uwalniając e. do wody

Główne składniki

-proteaza(Savinase)

-proteaza(Alkalase)

-amylaza(Termamyl)

-lipaza(Lipolase)

-celulaza(Celluzyme)

B) WYROBY TEKSTYLNE

-produkcja dżinsów

Enzymy:

-odbarwianie denimu(DeniLite)

-nadanie właściwości(DeniMax)

-dekatyzacja(Termamyl)

-wygładzanie(Cellusott)

-czyszczenie(Terminax)

C) KOSMETYKI

Soczewki kontaktowe

Enzymy

-mycie socz.kontakt.(Clear Lipo)

- mycie socz.kontakt(Clear Pro)

D) PIWO

-amyloglukozydaza do prod.piwa o małej zaw. węglowodanów AMG

-mieszanina enz zastępujących .enzymy słodkie(Ceremix)

-mieszanina karbohydraz ułatwiająca filtrowanie (Viscozyme)

-α amylaza upłynnienie dodatków zbożowych(Termamyl)

-pululanaza do prod piwa nisko weglowodanoweo (promozyme)

-proteaza do ekstrakcji białek ze słodu i jęczmienia osiągnięcia odp. Poziomu składników zaw.azot (Neutrase)

-α amylaza zwiększająca fermentację (Fungamyl)

E) GALANTERIA

WYR. SKÓRZANE

Enzymy

-odtłuszczanie( Greasex,Novolor)

-usuwanie włosów(NVE)

-zmiękczanie(Pancreatic, Trypsyn Novo, Novolor, Pyrase)

F) ALKOHOL

-bakt.amylaza do średniotemperaturowego upłyniennienia skrobi (Bacterial Amylase Novo-BAN)

-α amylaza grzybowa skracająca czas fermentacji

-bakteryjna α amylaza do wysokotemp.upłynniania skrobii(Liquozyne)

-bakt.proteaza ulepszająca wzrost drożdży

G) PIECZYWO

-oksydaza glukozowa- poprawia stabilność ciasta

-amylaza do zapobieg wietrzenia ciasta(Novamyl)

-oczyszczona lipaza 1,3 do pieczenia (Lipopan)

-ksylanaza/hemiceluloza do ogólnego polepszenia wytwarzania i jakości cząst. I chleba bez akt. Grzybowej α amylaza (Pentopan)

-amyloglukozydaza do zwiększ. Zaw.glukozy dla ciast chłodzonym lub mrożonym lub zapewnienia koloru skórce(AMG)

- α amylaza przyśpiesza rośnięcie chleba

H) SOKI

-różne pektynazy z akt. hemicelulolityczną stos. do zwiększ.wydajności soków z jabłek i gruszek (Pectinex)

-pektynazy z dodatk.akt.celulaz z hemiceluloz (Pectinex, Cellubrix)

-depektynowanie soku przez pektynotranseliminazę, poligalakturonazę i pektynoesterazę z uboczną akt. arabinozy ( Pectinex, Novoferm)

-degradacja skrobi przez amylogalatozydazę AMG

I) OLEJE I TŁUSZCZE

Poligalakturanaza do odgumiania olejów warzywnych i modyf.lecytyn (Lectiase)

Specyf. unieruchomienie lipazy do syntezy estrów(Novozym, Lipozyme)

Płynne lipazy do hydrolizy estrów

J) FARAMACEUTYKI

Proteolityczny enzym uzyskiwany z nieaktywnego trypsynogenu izolowanego z trzustki świń. Hydroliza białek na zaw. aktywnego inhibitora trypsyny do oczyszczania ran, czynników przeciwzapalnych czy usuwania kom. w hodowlach tkankowych. Często stosowany z nieokreśloną domieszką chymotrypsyny (Pancreatic Trypsyn Novo 6.0 S. Salti)

K) PRODUKCJA PAPIERU I MASY PAPIEROWEJ

--amylazy do niskotemp modyf. Skrobi (Aquazym,Fungamyl)

-celulaza do odbarw.

L) SKROBIA

-przekształcanie dekstryn w glukozę (AMG ,BAN)

-rozbijanie dekstranów do surowego soku cukrowego Dextranowe

-poprawa filtracyjności

-hydroliza inuliny do fruktozy(Fructozyme)

-α amylaza do uzysk.syropów bogatych w maltozę i glukozę (Fungamyl,Maltogenase)

-pululanaza do odgałęzienia skrobii redukcji zawartości oligosacharydów (Promozyme)

-ksylanaza do ulepszonego rozdziału glutenu i skrobi

-izomeraza glukozowa przekształc.glukozę we fruktozę(Sweetzyme)

-termostabilne bakterie α amylazy do rozkładu skrobi do dekstryn (Termamyl)

-termostabilna glukotransferaza cyklomaltodekstryny do produkcji cyklodekstryny (Tonizyme)

2. REAKCJA ŁAŃCUCHOWA POLIMERAZY PCR

Reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) – łańcuchowa reakcja polimerazy, metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki. Technika została wynaleziona w 1983 roku przez Kary'ego Mullisa z kalifornijskiej firmy Cetus, za co Mullis otrzymał w roku 1993 Nagrodę Nobla.

PCR znajduje wiele zastosowań, m.in. w badaniach nad genomem, charakterystyce ekspresji genów, klonowaniu genów, diagnostyce klinicznej, identyfikacji osób zaginionych, kryminalistyce, paleontologii.

Składniki mieszaniny reakcyjnej

Do reakcji wprowadza się:

  • matrycowy DNA,

  • trifosforany deoksyrybonukleozydów,

  • startery (primery), czyli krótkie (najczęściej ok. 20 nukleotydów) fragmenty DNA komplementarne do fragmentów matrycy, znajdujących się na obu końcach interesującego na genu, oraz

  • termostabilną polimerazę DNA. Używanym do reakcji enzymem może być na przykład polimeraza Taq wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus lub polimeraza Pfu z archeowców Pyrococcus furiosis. Polimeraza Pfu charakteryzuje się większą progresywnością niż Taq, jednakże działa wolniej. Dostępne są także inne polimerazy, będące z reguły modyfikacjami wyżej wymienionych.

Czasem dodaje się jeszcze innych składników np. roztworu tRNA zabezpieczającego adsorbcji innych składników mieszaniny na ściankach naczynia, barwniki i wskaźniki informujące o przebiegu reakcji (szczególnie w modyfikacjach PCR) i inne.

Przebieg reakcji

Reakcja PCR składa się z wielokrotnie powtarzanego cyklu trzech etapów, które zachodzą w rożnych temperaturach. Można zatem wymuszać je bez ingerencji w skład mieszaniny, a jedynie przez zmianę temperatury mieszaniny reakcyjnej.

  • reakcja PCR składa się z kilku etapów różniących się czasem trwania i temperaturą prowadzenia procesu:



T [C]

1)







3)

2)



czas

  1. denaturacja

  • czas denaturacji zależy od rodzaju polimerazy (m.in. jej termoodporności), planowanej liczby cykli i długości amplifikowanych cząsteczek

denaturacja wstępna (pierwsza) 3 – 5 min.

denaturacja (kolejne w trakcie cyklu) 15 – 30 s.

  • 95C (w określonych warunkach obniża się do 92C)

  • polimerazy termostabilne różnią się dokładnością i stopniem termostabilności (wytrzymałością na działanie wysokich temperatur)

temperaturą optymalną dla polimeraz DNA jest 75C, ale polimerazy termostabilne zachowują swoje właściwości w 95C (przyspieszenie procesu denaturacji) przez określony czas:

TAG około 30min.

DIPWENT i PRV około 7h

  1. annieling (przyłączanie starterów)

  • temperatura przyłączania starterów zależy od ich sekwencji i długości, wacha się w przedziale 40 – 65C

wartość temperatury annielingu jest o 4 - 5C mniejsza od temperatury topnienia układu hybrydowego, w skład którego wchodzi dany starter

  • gdy temperatura będzie za wysoka wystąpi brak przyłączeń (częstość przyłączeń będzie równa częstości oddysocjowywań) lub przyłączanie z niższą wydajnością (przyłączy się tylko część dostępnych starterów)

  • gdy temperatura będzie za niska startery mogą się przyłączać przy niepełnej komplementarności, powstaną niezgodne produkty (o długości różnej od produktu właściwego)

gdy w pierwszej reakcji powstaną już takie niewłaściwe produkty cała reakcja będzie już częściowo nastawiona na ich powielanie w postępie geometrycznym (nawet z jednej błędnej cząsteczki powstają miliony kopii, dlatego właściwy dobór temperatury jest taki ważny!)



*temperatura topnienia

temperatura w której ½ cząsteczek DNA jest denaturowana (rozdzielona na pojedyncze nici)

zależy od liczby wiązań wodorowych wytworzonych między nićmi:

2(A+T)+4(G+C)

2 razy (wiązanie podwójne) liczba par AT + 4 razy (siła wiązania potrójnego nie jest proporcjonalnie większa od siły wiązania podwójnego) liczba par GC

  1. elongacja (wydłużanie starterów, reakcja syntezy nowej nici)

  • czas trwania zależy od długości produktu, który ma powstać, ale nie przekracza 2min.

  • 72C (temperatura optymalna dla większości polimeraz, ale zdarza się także 68C i 70C)


etapy reakcji PCR

  • etap I

  • denaturacja dwuniciowej cząsteczki matrycowej

  • przyłączenie startera komplementarnego do nici I (matryca pierwotna a)

  • przyłączenie startera komplementarnego do nici II (matryca pierwotna b)

  • synteza nici o przypadkowej długości, przeważnie dłuższych niż oczekiwany produkt – powstaje produkt pierwotny, ograniczony z jednej strony, jednym starterem (a lub b)





a







b



matryce fragmenty produkt pierwotny starter

które chcemy

amplifikować



  • etap II

  • denaturacja matrycy od produktu pierwotnego

  • teraz produkt pierwotny będzie stanowił matrycę właściwą reakcji

  • powstaje produkt właściwy, ograniczony obustronnie, obydwoma starterami (a i b)

powstaje też kolejna kopia produktu pierwotnego na pierwotnej matrycy



a







b



matryce fragmenty starter produkt właściwy

produktu które chcemy

pierwotnego amplifikować



  • kolejne etapy

  • następuje wzrost procentowego udziału produktu właściwego

  • po trzydziestu cyklach z jednej cząsteczki matrycy początkowej powstaje 229 cząsteczek produktu właściwego

  • w czasie trwania reakcji PCR mamy do czynienia z trzema rodzajami DNA





matryca początkowa, którą umieściliśmy w mieszaninie reakcyjnej

produkt pierwotny (przyrost liniowy)

produkt właściwy (przyrost geometryczny)





liczebność

DNA













liczba cykli



  • planowanie i optymalizacja reakcji PCR

  • projektowanie starterów

  • długość

  • długość starterów zależy od celu reakcji

  • im więcej informacji jest znanych, tym dłuższe konstruuje się startery, nawet do 40 nukleotydów, ale nawet przy dużej ilości danych przeważnie dwadzieścia kilka

  • przy poszukiwaniu bliżej nieokreślonych rejonów korzysta się ze starterów dziesięcio nukleotydowych

  • najczęściej stosowana długość w reakcjach PCR to 18 – 22 nukleotydy

  • sekwencja

  • sekwencja starterów zależy od sekwencji fragmentu, który chcemy amplifikować

  • inne warunki

  • startery w „parze” należy odpowiednio dobrać, dopasować

  • muszą mieć podobne temperatury topnienia(!), ponieważ będą przyłączane w tej samej temperaturze reakcji (dopuszczalne są różnice najwyżej 1 – 3C)

  • nie mogą być komplementarne w żadnym miejscu

  • w obrębie pojedynczego startera nie mogą zawierać sekwencji palindromowych

  • liczba par GC powinna stanowić 40 – 60% długości startera

  • optymalizacja pozostałych składników reakcji

  • stężenie jonów Mg2+

  • stężenie jonów dwudodatnich metalu jest charakterystyczne dla danej polimerazy (rodzaju, partii)

  • brak jonów powoduje całkowite pozbawienie polimerazy aktywności

  • niedobór jonów ogranicza aktywność polimerazy

  • nadmiar jonów powoduje ograniczenie dokładności polimerazy, możliwe jest zachodzenie niespecyficznej amplifikacji

  • właściwe stężenie jonów magnezowych 1 -3 mMol

  • precyzyjny dobór stężenia odbywa się doświadczalnie:

do kolejnych probówek dodaje się co 0,5 jednostki jonów w zakresie 0,5 – 3 mMol, a następnie obserwuje się jakość amplifikacji na żelu

  • stężenie polimerazy

  • przeważnie wprowadza się 0,5 – 1,5 jednostki polimerazy na reakcję

  • zwiększenie stężenia nie zwiększa wydajności reakcji, zwiększa koszt i może wywołać pojawienie się aktywności egzonukleazowej 5’  3’

  • duży nadmiar wywołuje smir – cień na żelu spowodowany obecnością fragmentów mniejszych niż oczekiwany produkt, o niespecyficznych długościach

  • wybór enzymu

  • polimerazy mają różne dokładności



*produkty do PCRu i sekwencjonowania należy dobrać na podobnie dobrym poziomie, a nawet próbka do reakcji PCR powinna być lepszej jakość



  • od wyboru enzymu zależy temperatura denaturacji i wydłużania

  • stężenie matrycy

  • (stężenie startera to około 50pM)

  • stężenie matrycy to około 10 – 100ng

  • ważny jest odpowiedni dobór proporcji

  • nadmiar matrycy prowadzi do produkcji dużych ilości produktu pierwotnego, co powoduje zbyt duże zużycie starterów w dalszych etapach reakcji i spowolnienie przyrostu ilościowego produktu właściwego

sytuacja jest bardzo zła, gdy w reakcji pozostaje tyle matrycy i/lub produktu pierwotnego, że są one widoczne w postaci prążka na żelu!

  • PCR jest reakcją bardzo czułą, amplifikacja i otrzymanie wystarczającej ilości produktu jest możliwe nawet z jednej cząsteczki DNA

<25μl  bardzo mała ilość matrycy wyjściowej

25μl standardowa ilość

100μl  ilość dla większych reakcji

  • kontrole

  • pozytywna

upewnienie się, że brak produktu – brak prążka, to oznaka, że rzeczywiście nie istnieje, czy to tylko błąd któregoś z elementów składowych reakcji

(może być niewłaściwe stężenie DNA, nieaktywna polimeraza, zdegradowane startery)

próbka kontrolna, dla upewnienia się, że matryca jest funkcjonalna, polimeraza nie jest zanieczyszczona, sprzęt działa

sprawdzanie starterów – czy reakcja zajdzie, czy nie (odpowiedź PCR – produkt, czy brak produktu)

założenie właściwego zaprojektowania reakcji i starterów

  • negatywna

monitoring tła



Analiza produktów PCR:

I stopień:

1. elektroforeza w żelach agarozowych, barwienie bromkiem etydyny, autoradiografia

2. elektroforeza w żelach poliakryloamidowych, barwienie bromkiem etydyny, srebrzenie,

autoradiografia.

II stopień:

  1. RFLP – PCR

  2. wewnętrzna PCR

  3. hybrydyzacja ASO

  4. sekwencjonowanie


Zdegenerowane sekwencje/manipulacja sekwencjami:

  1. startery ze zmienionymi końcami 5’

- miejsca restrykcji

- sekwencja promotora

- sekwencja startera

2. zdegenerowane startery

- izolacja klonów cDNA

- startery dedukowane z odwrotnej translacji

3. odwrócona PCR

- tworzenie struktur kolistych

- ligacja dwuniciowych oligonukleotydów

- wydłużanie końca 3’ przez terminalną transferazę

4. starery uniwersalne

5. mutageneza ukierunkowana - startery z niesparowaniami

6. pośrednia mutageneza

- błędy polimerazy Taq


Wpływ PCR na rozwój gen. Molekularnej:

TEST DIAGNOSTYCZNY:

1945 – precypitacja białek

1965 – test aglutynacji

1983 – ELISA

BADANIE MOLEKULARNE DNA:

1953 – struktura DNA

1968 – enzymy restrykcyjne

1972 – klonowanie DNA

1975 – transfer Southerna

1977 – izolacja genu człowieka, sekwencjonowanie DNA

1978 – RFLP

1985 – PCR


Główne zastosowania:

- klonowanie: YAC, BAC

- hybrydyzacja: klony cDNA, produkty PCR

- amplifikacja: PCR

- sekwencjonowanie: klony genomowe, produkty PCR



Warianty PCR

  1. multipleks PCR:

przykład z dystrofii mięśniowej Duchenne’a

- jednorazowo można amplifikować ok. 10 markerów, do badań wystarcza 1ng DNA, można badać DNA zmieszany i zdegenerowany, stosuje się różne barwniki fluorescencyjne, zastosowanie: duże mutacje genowe (delecje duplikacje insercje)

2. PCR – RFLP, Polimorfizm fragmentów restrykcyjnych

- obecność lub zanik miejsca rozpoznawanego przez endonukleazy restrykcyjne lub zmiana liczby nukleotydów między takimi miejscami, dziedziczenie kodominujące, analiza bezpośrednia – mutacje, analiza pośrednia – polimorfizmy

3. PCR – SSCP, polimorfizm konformacji jednoniciowych fragmentów DNA

- Badany DNA jest amplifikowany klasyczną techniką PCR, następnie termiczna denaturacja produktów PCR w buforze obciążającym z dodatkiem czynnika denaturującego, elektroforeza w natywnym żelu poliakryloamidowym, szybkość migracji zależna od wielkości oraz konformacji

4. PCR – HD, analiza heterodupleksów

- stosowana zarówno do produktów PCR o wielkości poniżej 200pz jak i powyżej 400pz, wykrywanie mutacji i poszukiwanie nowych, w wyniku hybrydyzacji nie w pełni komplementarnych nici powstają struktury pęcherzyka (zgięcie nici – DNA) lub wybrzuszenie o zmienionej migracji. Przykład choroby: zespół Marfana

5. PCR – DHPLC, analiza heterodupleksów metodą wysokosprawnej denaturującej chromatografii cieczowej

- jonowymienna chromatografia cieczowa na kolumnach, dwa eluenty o pH 7, elucja fragmentów DNA w buforze TEAA

6. PCR – MLPA, amplifikacja multipleks zależna od ligacji sond molekularnych

- do wykrywania delecji i duplikacji eksonów, starter krótki komplementarny do docelowej sekwencji i do znakowanego startera PCR, drugi starter komplementarny do docelowej sekwencji uzyskany w wektorze M13, ligacja hybrydyzowanych sond i ich amplifikacja z zastosowaniem jednej pary starterów, sekwencja docelowa 50 – 70 nt, zastosowanie np. mukowiscydoza

7. RAPD – PCR, losowa amplifikacja polimorficznego DNA

- stosuje się pojedynczy dowolny starter o długości od kilku do kilkunastu nukleotydów, amplifikacja kilku do kilkudziesięciu różnych fragmentów DNA, niska temp wiązania startera, komercyjnie dostępne zestawy starterów

8. VNTR – PCR, zmienna liczba tandemowych powtórzeń

- locus człowieka amplifikowano metodą PCR z zastosowaniem startera znakowanego, produkty PCR rozdzielono w żelu poliakrylamidowym, allele identyfikowano na podstawie porównania wielkości i drabiny alleli. Zastosowanie : badanie rodzicielstwa.

9. ASA – PCR, specyficzna dla allelu reakcja PCR

- metoda pozwalająca rozróżnić allele badanego fragmentu, startery (sondy molekularne) rozpoznają allel typu dzikiego lub allel zmutowany, obecnie bardzo często w połączeniu z metodą Real Time PCR.

10. DOP – PCR, ze zdegenerowanym starterem oligonukleotydowym

- amplifikacja niescharakteryzowanych albo nieznanych regionów DNA, startery zawierają blisko końca 3’ zdegenerowany fragment 6 nukleotydowy reprezentujący wszystkie możliwe układy i następnie fragment bogaty w GC, pierwsze 5 cykli w niskiej temp a następne w 72stC.

11. RT – PCR, cDNA-PCR

- odwrotna transkrypcja, synteza cDNA

- modyfikacja polegająca na użyciu mRNA jako matrycy. Synteza DNA na matrycy mRNA odbywa się przy użyciu odwrotnej transkryptazy (RT). Następnie DNA namnaża się za pomocą zwykłej reakcji PCR. Metoda ta pozwala na amplifikację wyłącznie sekwencji zawartej w dojrzałym mRNA, a więc tylko egzonów. Powstały DNA określany jest jako cDNA – komplementarny DNA.

12. Real time PCR

- do środowiska reakcji wprowadzane są znakowane (np. barwnikami fluorescencyjnymi) nukleotydy bądź sondy łączące się z DNA, które pozwalają na podstawie odczytów w kolejnych cyklach określić ilość matrycy użytej do reakcji, jak również śledzić ilość powstającego produktu.


SEKWENCJONOWANIE DNA


Sekwencjonowanie jest techniką pozwalającą określić kolejność nukleotydów w badanym fragmencie DNA i stosowane jest w wielu dziedzinach badań molekularnych.

Sekwnecjonowanie ujawniło bogactwo informacji dotyczącej architektury genów, kontroli ekspresji genów i struktury białek.


GŁÓWNE ZASTOSOWANIA

  • poznanie struktury genów

  • inżynieria genetyczna

  • mapy fizyczne i genetyczne

  • identyfikacja ramek odczytu (ORF)

  • analiza końców 3’ i 5’ genów

  • mutageneza ukierunkowana

  • diagnostyka molekularna

ZAŁOŻENIA

  • rozdział elektroforetyczny w denaturującym żelu poliakrylamidowym (żel sekwencyjny) lub nośniku w kapilarze

  • rozdział pojedyńczoniciowych fragmentów DNA o wielkości do 800 pz różniących się o 1 nukleotyd

  • cztery enzymatyczne (chemiczne) reakcje, które ulegają terminacji w pozycji A, C, G, lub T

  • odczyt sekwencji z czterech lub jednego toru elektroforetycznego

GŁÓWNE METODY

  1. Metoda enzymatyczna (Sangera) – 1977r. – metoda terminacji łańcucha, sekwencjonowanie izotermiczne

    • Przygotowanie mieszaniny inkubacyjnej: matryca (jednoniciowe DNA), starter, polimeraza DNA, dNTP (znakowanych izotopami radioaktywnymi), bufor. Mieszaninę dzieli się na 4 porcje i do każdej z nich dodaje się inny ddNTP (brak gr. OH w pozycji 3’ deoksyrybozy – niemożliwe dołączenie kolejnego nukleotydu)

    • Polimeraza DNA rozpoczyna wydłużanie startera zgodnie z zasadą komplementarności (za każdym razem jest szansa, że zamiast dNTP włączy się ddNTP i nastąpi terminacja elongacji)

    • Po inkubacji uzyskujemy 4 zestawy łańcuchów kończących się odpowiednim ddNTP

    • Przeprowadzamy elektroforezę ( 4 równoległe ścieżki na żelu poliakrylamidowym), a następnie autoradiografię

    • Sekwencję DNA określa się od dołu żelu

    • Stężenie ddNTP jest na tyle małe, że terminacja syntezy łańcucha występuje okazjonalnie. Dzięki temu będą powstawać fragmenty o różnej długości, ale zawsze zakończone ddNTP.

Obecnie DNA jest sekwencjonowany w sposób automatyczny opierając się na metodzie Sangera, ale z zastosowaniem startera wyznakowanego fluorescencyjnie – o innej barwie dla każdej z 4 reakcji (np. emitujący światło niebieskie dla łańcuchów zakończonych A, a czerwonej dla zakończonych C). Dlatego po inkubacji możliwe jest połączenie mieszanin i wspólny ich rozdział elektroforetyczny na jednej ścieżce. Laserowy detektor rozróżnia i identyfikuje każdy z produktów w miarę ich wypływania z żelu (kolejność występowania kolorów).


  1. Metoda chemicznej degradacji (Maxama i Gilberta)

    • Działamy na dwuniciowy DNA związkami chemicznymi rozszepiającymi cząsteczki w specyficznych pozycjach poszczególnych nukleotydów.

    • Odczynniki tną specyficznie nić DNA w miejscu występowania nukleotydu

    • Przed działaniem odczynników DNA jest znakowane na jednym z końców 5’

    • fragment DNA ulega reakcji z odczynnikami specyficznymi dla poszczególnych zasad, następnie dodaje się piperydyny, która rozpoznaje miejsce połączenia odczynnika z nukleotydem i w tym miejscu nacina nić DNA.

    • Modyfikacja zasad zachodzi w 4 oddzielnych reakcjach dla każdej próbki (G, A+G, C+T, C) – trudność w uzyskaniu chemicznej reakcji specyficznie degradującej w pozycji A i T.

    • Elektroforeza, odczytanie sekwencji od dołu żelu.

    • ZALETA: bezpośrednia metoda chemiczna – niewrażliwa na sekwencje trudne do przepisania przez polimerazy DNA.

    • W metodzie wykorzystano odczynniki: siarczan dwumetylu (DMS) - G, hydrazynę – C+T, hydrazyna w obecności NaCl – C, kwas mrówkowy – A+G – modyfikujące zasady w analizowanym fragmencie DNA

    • Przecięcie – piperydyna


ELEKTROFOREZA

  1. Płytowa – w żelu poliakrylamidowym, odczyt na skanerze fluorescencji. Dla każdej próbki potrzebne są 4 ścieżki lub jedna ścieżka, gdy stosowane są 4 znaczniki fluorescencyjne. Detektor rejestruje migracje fragmentów DNA. Stosowanie laserów stacjonarnych i ruchomych, zarówno monochromatycznych jak i polichromatycznych. Stosowne markery: błękit bromofenolowy, cyjanoksylen

  2. Kapilarna – odczyt w laserze stacjonarnym, polichromatycznym. Detektor rejestruje migrację fragmentów DNA. W pojedynczej kapilarze rozdzielane są fragmenty DNA znakowane 4 znacznikami fluorescencyjnymi.

Elektroforeza kapilarna

Elektroforeza kapilarna (CE, od ang. Capillary Electrophoresis), zwana też elektroforezą w wolnym buforze służy najczęściej do rozdziału niewielkich cząsteczek (podobnie jak HPLC). Metoda ta jest często stosowana w biologii molekularnej do analizy DNA, znacznie rzadziej do rozdziału peptydów. Rozdział mieszanin prowadzony jest w cienkiej (wewn. średnica 25-100 µm) i długiej (0.5-1 m) kapilarze kwarcowej, przypominającej z wyglądu światłowód. Kapilara ta wypełniana jest buforem.

Próbka wprowadzana jest do wlotu kapilary, po czym jest do niej przykładane wysokie napięcie elektryczne (do 30 kV). U wylotu kapilary zamontowany jest detektor, który rejestruje wychodzenie z rurki kolejnych związków chemicznych. Bufor płynie przez kapilarę ze stałą szybkością w stronę jednej z elektrod. Dla układu wodnego jest to zwykle katoda.

Technika ta umożliwia rozdzielanie anionów i kationów soli organicznych i nieorganicznych.

ETAPY SEKWENCJONOWANIA dsDNA

  1. denaturacja matrycy

  2. przyłączenie startera

  3. synteza DNA – reakcja zachodzi w czterech oddzielnych probówkach (A, C, T, G).

Skład mieszaniny reakcyjnej: matryca, znakowany starter i dNTP, bufor, polimeraza DNA, ddNTP

  1. denaturacja DNA

  2. rozdział elektroforetyczny


SEKWENCJONOWANIE CYKLICZNE

Do probówki dodajemy: oczyszczony produkt PCR, starter znakowany izotopem lub fluorochromem, polimeraza Tag, dNTP, ddNTP

Materiałem wyjściowym jest dsDNA (PCR, klonowanie), do reakcji wystarcza nawet niewielka ilość matrycowego DNA.

Sekwencjonowanie to przeprowadza się w sposób podobny do PCR (etap denaturacji, przyłączania startera i jego elongacja), ale z zastosowaniem jednego startera, każda z reakcji zawiera inny ddNTP.

Liczba cykli 20-45.

Analiza na żelu poliakrylamidowym.


ZNACZNIKI W SEKWENCJONOWANIU

  • Radioaktywne - znakują dNTP, startery na końcu 5’ (w obecności kinazy polinukleotydowej)

- [α35S]dATP, [α32P]dATP – stosowanie 32P umożliwia krótką ekspozycję i jest bardzo przydatne do oceny konstrukcji genetycznych. Lepsza rozdzielczość przy zastosowaniu 35S.

- [α33P]dATP – ma maksymalną emisję promieniowania β (silniejszą od 35S i pięć razy niższą od 32P)

- [γ35S]dATP, [γ32P]dATP – do znakowania kinazą polinukleotydową T4 końca 5’ startera

33P i 35S mała energia emisji w stosunku do 32P

autoradiografia, stosowanie promieniotwórczych znaczników ma wady: odpady radioaktywne, specjalne połączenia do pracy

  • Fluorescencyjne - znakują ddNTP lub starter

- barwnik HEX, TMR, ROX, FAM, JOE (laser 532nm)

- barwniki Cy5’ (laser 633nm)


Sekwnecjonowanie genomu

      1. Fragmentowanie genomu metodą sonikacji

      2. Rozdział fragmentów na żelu

      3. Wyizolowanie z żelu i połączenia z wektorami = utworzenia biblioteki genomowej

      4. Reakcja sekwencjonowania klonów

      5. Składanie przy użyciu programu komputerowego


Metody sekwencjonowania zostały zautomatyzowane (od 1987 stosuje się sekwencjonery) co pozwoliło na szybki postęp w dziedzinie sekwencjonowania całych genomów. W 1995 poznano pierwsze genomy bakterii (Haemophilus influenzae i Mycoplasma genitalium), w 1997 genom pierwszego eukarionta - drożdży piekarskich (Saccharomyces cerevisiae), w 1998 genom pierwszego organizmu wielokomórkowego nicienia Caenorhabditis elegans, w 2000 genom muszki owocowej (Drosophila melanogaster), w 2000 genom rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana)



Programy poznawania genomów

Rozpoczęte programy (stan maj 2004)

- poznanie genomu pszczoły, żaby szponiastej, kury, psa, kota, kangura, owcy, świni, kawy, kukurydzy


Zakończone programy: genom człowieka, myszy, bydła


PODSUMOWANIE

Matryce w reakcji sekwencjonowania: jednoniciowy lub dwuniciowy DNA amplifikowany przez PCR lub klonowanie.

Matryce muszą charakteryzować się bardzo dobrą jakością i czystością, bo reakcja sekwencjonowania jest reakcją enzymatyczną i wszelkie zanieczyszczenia mogą mieć negatywny wpływ na jej przebieg.


  • DNA musi być odbiałczony i pozbawiony RNA

  • Produkt PCR musi być oczyszczony – pozbawiony niewykorzystanych składników (sole buforu, polimeraza DNA, startery, dNTP)

Oczyszczanie produktu PCR poprzez

- ekstrakcja z fenolem i chloroformem, a potem precypitacja etanolem niska wydajność, nieusunięte startery)

- stosowanie specjalnych zestawów do oczyszczania

- stosowanie enzymów: egzonukleazy I i alkaliczna fosfataza – usuwają startery, dNTP – następnie dezaktywacja tych enzymów poprzez inkubacje w wysokiej temp.

- znakowanie starterów biotyną – stąd możliwe ich późniejsze usunięcie

- oczyszczanie na kolumnach

  • Stosowane polimerazy

Pozbawione aktywności egzonukleazowej 5’→3’ (skraca nić) i 3’→5’ (aktywność korygująca – ddNTP byłyby wycinane)

- pol. T7 – nie jest termostabilna, wysoka procesywność, sekwnecjonowanie izotermiczne 37oC

- pol. Tag – termostabilna, sekwencjonowanie cykliczne

  • Oczyszczenie z nadmiaru ddNTP – nieproporcjonalne wyniki – na kolumienkach, wytrącenie etanol:octan amonu



  1. PIROSEKWENJONOWANIE


Pirosekwencjonowanie jest to metoda sekwencjonowania DNA w czasie rzeczywistym.


Właściwości tchnologii:

- sekwencjonowanie DNA w czasie rzeczywistym

- bez elektroforezy

- bez znaczników

- krótki czas

- zależności ilościowe

- format płytkowy

- wysoka wydajność

Historia pirosekwencjonowania:

- sekwencjonowanie krótkich odcinków DNA,

- technologie opracował Paul Nyren z RIT w Sztokholmie w 1996 roku

- szereg patentów w 1985r

- przełom w 1996 po wprowadzeniu apirazy.

Technologia pirosekwencjonowania:

- sekwencjonowanie w czasie rzeczywistym,

- jednorazowe dodawanie jednego nukleotydu,

- wykrywanie wbudowania nukleotydów – uwalnianie pirofosforanu,

- degradacja niewbudowanego nukleotydu przez apirazę.

Składniki:

-enzymy i substraty

- matryca (jednoniciowy fragment DNA)– produkty PCR ( w celu namnożenia)

- starter sekwencyjny

- jony Mg

  1. Dodanie mieszaniny zawierającej 4 enzymy: polimerazę DNA, sulfurylazę ATP, lucyferazę, apirazę oraz substraty: adenozyno 5’-fosfosiarczan (APS) i lucyferynę.

  2. Dodanie trifosforanu deoksynukleotydu.

  3. Wbudowanie lub nie nukleotydu.

  4. Jeżeli dany nukleotyd jest komplementarny do matrycy to polimeraza wbudowuje go uwalniając jednocześnie pirofosforan. Sulfurylaza ATP przekształca pirofosforan do ATP wykorzystując adanozyno-5-fosfosiarczan. PPi + APS -> ATP + H2SO4

  5. ATP umożliwia lucyferazie przekształcenie lucyferyny w oksylucyferynę, prowadząc do emisji światła proporcjonalnie do ilości ATP.

  6. Apiraza w sposób ciągły degraduje ATP i niezwiązane nukleotydy, co zamyka cykl i regeneruje mieszaninę reakcyjną. W następnym etapie dodawany jest kolejny nukleotyd i reakcja (cykl) powtarza się.

Pirosekwencjonowanie – układ enzymów apiraza

polimeraza dNTP dNMP + fosforan

(DNA)n + dNTP (DNA)n+1 + PPi ATP ADP + AMP + fosforan

apiraza

Etapy analizy:

  1. Amplifikacja bakteryjnego regionu metoda PCR z biotynylowanym starterem.

  2. Wiązanie biotynylowanego produktu PCR do kulek pokrytych streptoawidyną.

  3. Rozdzielenie nici po denaturacji w NaOH.

  4. Przemywanie? i neutralizacja? Związanego fragmentu.

  5. Przyłączenie startera sekwencyjnego

Dla objaśnienia :P :Primery jednej z nici muszą być wyznakowane biotyną, co pozwala na separację jednoniciowych odcinków dzięki związaniu ich ze streptawidyną, która ma silne powinowactwo do biotyny. Do separacji jednoniciowych odcinków, wykorzystuje się specjalne urządzenie zasysające oraz końcówki z filtrem, na którym osadza się złoże sefarozowe opłaszczone streptawidyną. Badane odcinki DNA wiążą się z tym złożem, a kolejne etapy denaturacji i odpłukania powodują, iż w efekcie uzyskuje się jednoniciowe matryce. Są one następnie uwalniane ze złoża do specjalnej płytki z roztworem starterów sekwencyjnych. Związania starterów z matrycami dokonuje się poprzez ogrzanie płytki w 90 st. C, a następnie schłodzeniu jej do 45 st. C. Tak przygotowaną płytkę umieszcza się w urządzeniu sekwencjonującym, uzupełnia dozowniki reagentami i uruchamia sekwentator. Od tej pory dalsze etapy wykonywane są przez maszynę automatycznie.

Sekwentator automatycznie dozuje reagenty do mieszaniny, a wyniki wyświetlane są w czasie rzeczywistym na ekranie komputera. Szybkość reakcji to jedna minuta na jeden wbudowany nukleotyd. Poszczególne próbki w dołkach płytki analizowane są w tym samym czasie niezależnie od siebie. Emitowany sygnał świetlny zostaje wychwycony przez zamontowaną kamerę, a informacja przesłana do podłączonego komputera. Intensywność piku świetlnego zostaje przełożona, przy pomocy odpowiedniego oprogramowania, na sekwencję nukleotydową badanego odcinka DNA.

Zależność intensywności piku świetlnego od ilości wbudowanych nukleotydów
Rys.1. Zależność intensywności piku świetlnego od ilości wbudowanych nukleotydów


Jak obrazuje przedstawiony powyżej wykres, im wyższy jest pik świetlny, tym większa ilość nukleotydów została wbudowana kolejno po sobie. Brak sygnału świetlnego świadczy o tym, że nukleotyd nie został wbudowanym z powodu niekomplementarności. Po zakończeniu sekwencjonowania, wynik jest zapisywany w pliku, który można poddać dalszej analizie.

Pirosekwencjonowanie cechuje wiele zalet, którymi są:

  • Czułość - analiza występujących mutacji punktowych obejmujących zmianę tylko jednego nukleotydu.

  • Specyficzność - dzięki zastosowaniu reakcji PCR oraz znakowania biotyną starterów, próbka podlegająca sekwencjonowaniu zawiera tylko i wyłącznie badany fragment DNA.

  • Redukcja kosztów - koszt zsekwencjoncjonowania pojedynczej próbki przy zastosowaniu technologii pirosekwencjonowania wynosi 69 centów, natomiast przy jednoczesnym sekwencjonowaniu dużej ilości prób, spada aż do 20 centów.

  • Automatyzacja - dzięki wykorzystaniu podłączonej do sekwentatora kamery i specjalnego oprogramowania, pozwala na niemalże całkowitą automatyzację procesu. Wymagane jest jedynie odpowiednie przygotowanie próbki do sekwencjonowania oraz uzupełnienie dozowników reagentami. Cała procedura sekwencjonowania wykonywana jest przez urządzenie.

  • Szybkość analizy - przy wykorzystaniu pirosekwencjonowania, czas upływający od pobrania próbki, który obejmuje izolację materiału genetycznego, jego namnożenie oraz przygotowanie, wynosi kilka godzin. Zastosowanie standardowego sekwencjonowania, wydłuża ten proces do paru dni.

  • Ilościowa korelacja - intensywność sygnału podczas pirosekwencjonowania jest determinowana ilością występujących po sobie kolejno tych samych nukleotydów.

Zastosowanie:

Pirosekwencjonowanie znalazło zastosowanie w takich analizach jak: badanie sekwencji odcinków DNA, wykrywanie mutacji i polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (w tym diagnostyka związanych z tym chorób),genotypowanie wirusów i bakterii, badanie mitochondrialnego DNA oraz wielu innych.

Jest jednak metoda drogą. Umożliwia sekwencjonowanie tylko krótkich fragmentów (50 -60 nukleotydów), bo w mieszaninie reakcyjnrj z każdym cyklem zwiększa się ilośść zanieczyszczeń.


5. BIBLIOTEKI DNA


Biblioteka DNA (inaczej bank DNA) stanowi zbiór fragmentów DNA danego organizmu włączonych do cząsteczek wektorów i wprowadzonych do komórek bakterii, fagów lub wirusów przy wykorzystaniu zjawiska transformacji. W dobrze skonstruowanej bibliotece każda sekwencja genomowego DNA ma swoją reprezentację w postaci klonu.


Liczba klonów niezbędnych do pokrycia genomu przez bibliotekę zależy od wielkości sklonowanych fragmentów DNA. Liczbę tę można obliczyć ze wzoru Clarke`a i Carbona :



N=ln(1-P)/ln[1-(I/G)]

gdzie :

N - ilość niezależnych klonów

P - prawdopodobieństwo obecności danej sekwencji w banku (przyjmuje się 99%)

I - wielkość średniego insertu (wstawki) w wektorze wyrażona w parach zasad

G - wielkość genomu w parach zasad

Istnieją dwa typy bibliotek DNA:

Genomowe

cDNA

Biblioteka genomowa jest zbiorem różnych fragmentów genomowego DNA danego organizmu, wklonowanych do cząsteczek wybranego wektora genetycznego. Reprezentatywna biblioteka zawiera fragmenty, które łącznie obejmują cały genom organizmu.

Biblioteki genomowe zawierają zarówno DNA kodujące (geny, egzony), jak i niekodujące (introny, sekwencje regulatorowe, repetytywne, ruchome i inne o nieznanym znaczeniu). Wynika z tego, iż taka biblioteka jest niezastąpiona, gdy szukanym odcinkiem DNA jest nie gen, ale np. promotor, enhancer czy inna sekwencja regulacyjna. Ponadto tylko taka biblioteka może posłużyć do sekwencjonowania genomu, Wadą takiej biblioteki może być brak całości genu, jeśli enzym użyty do konstrukcji banku ma miejsce cięcia w obrębie interesującej sekwencji. Istnieje jednak rozwiązanie takiego problemu. Można dobrać warunki trawienia tak, aby enzym nie trawił we wszystkich możliwych miejscach, a jedynie w dalekich od siebie odległościach. Jeśli tworzona bibliotek ma służyć do całkowitego sekwencjonowania danego genomu to niezbędne jest uporządkowanie klonów celem rekonstrukcji naturalnego układu DNA organizmu. Możliwe jest to gdy fragmenty DNA częściowo wzajemnie nakładają się. Taka biblioteka osiągana jest przez losową fragmentację DNA ( sonifikacja lub niepełna hydroliza enzymatyczna DNA).


Przygotowanie biblioteki obejmuje następujące etapy:

Izolacja DNA. W zależności od typu biblioteki, którą pragniemy uzyskać izolujemy całkowity DNA lub DNA z danego typu organelli, np. jąder, mitochondriów.

Izolacja DNA do konstrukcji bibliotek o wielkości insertów powyżej 1 Mpz odbywa się przez unieruchomienie komórek, protoplastów lub jąder na małych bloczkach żelu agarozowego w postaci korków lub mikropaciorków. Agaroza tworzy sieć przestrzenną, zabezpieczającą DNA przed fiz. uszkodzeniem i umożliwia dyfuzję odczynników. Unieruchomione w żelu komórki są poddawane hydrolizie proteinazą K w obecności sarkozylu. W przypadku roślin dodatkowym utrudnieniem jest konieczność uzyskania protoplastów lub jąder kom. ponieważ ściana kom. uniemożliwia izolację wysokocząsteczkowego DNA.

2. Fragmentacja DNA. DNA poddajemy fragmentacji z wykorzystaniem enzymów restrykcyjnych lub metod fizycznych takich jak np.

sonikacja. Trawienie restrykcyjne (częściowe) wykonuje się na ogół w taki sposób, by uzyskać fragmenty dłuższe niż wynikałoby to z rozmieszczenia miejsc restrykcyjnych. Dzięki klonowaniu dłuższych fragmentów można uzyskać reprezentatywną bibliotekę

obejmującą mniejszą liczbę klonów. W przypadku zastosowania sonikacji należy uwzględnić fakt, że powoduje ona powstanie fragmentów zawierających jednoniciowe końcówki. Dlatego przed ligacją z wektorem należy wykonać dodatkowy zabieg, celem którego będzie uzyskanie końcówek dwuniciowych.

3. Selekcja pod względem wielkości przez rozdział elektroforetyczny w pulsacyjnym polu elektrycznym.

4. Ligacja z wektorem. Każdy fragment DNA, który ma być stabilnie utrzymywany w bibliotece, musi zostać połączony z cząsteczką

DNA wektora genetycznego. Ze względu na znaczną długość klonowanych fragmentów genomowego DNA do tego celu wykorzystujemy wektory konstruowane m.in. na bazie faga λ lub kosmidy.

5. Transformacja. DNA biblioteki należy umieścić w komórkach np. E.coli lub drożdży, które następnie rozsiewane są na szalki selekcyjne

w celu uzyskania pojedynczych klonów, z których każdy zawiera inny fragment genomu.


Biblioteka cDNA jest zbiorem cząsteczek reprezentujących sekwencje ulegające transkrypcji w danym organizmie.

Biblioteki cDNA są zbiorem genów!- każdy klon zawiera jeden cały gen. Wiadomo, że bakterie nie mają zdolności przeprowadzania splicingu. Dzięki braku intronów sekwencje z biblioteki cDNA można wprowadzić bezpośrednio do komórek bakteryjnych z uzyskaniem efektywnej produkcji danego białka. Inną zaletą posiadania biblioteki cDNA jest możliwość stwierdzenia, które geny są aktywne w danym typie komórek lub tkanek i w jakim stopniu. Z drugiej jednak strony taka właściwość biblioteki cDNA stanowi pewną wadę. Może się bowiem zdarzyć, że nie uzyskamy cDNA z genów, które nie są w danym momencie i w danej tkance aktywne transkrypcyjnie.

Przygotowanie

biblioteki cDNA obejmuje następujące etapy:

1. Izolacja RNA. Zdecydowana większość cząsteczek RNA izolowanych z komórek reprezentuje dojrzałe transkrypty genów. Jeżeli

chcemy uzyskać bibliotekę zawierającą wyłącznie klony kodujące białka, należy oddzielić mRNA od pozostałych typów RNA tj. rRNA,

tRNA, snRNA.

2. Synteza cDNA. Syntezę cDNA wykonuje się z wykorzystaniem odwrotnej transkryptazy oraz dwóch typów starterów. Startery z

sekwencją poli(T) przyłączają się do sekwencji pola(A), obecnych na 3’ końcach dojrzałych cząsteczek mRNA. Od tego miejsca

odwrotna transkryptaza rozpoczyna syntezę pierwszej nici cDNA. Do uzyskania biblioteki cDNA stosować można również krótkie

startery o przypadkowej sekwencji (ang. random primer). Oligonukleotydy te przyłączają się do różnych obszarów sekwencji RNA co

ułatwia syntezę dłuższych cząsteczek cDNA niż w przypadku użycia wyłącznie starterów poli(T).

3. Ligacja z wektorem. Do klonowania sekwencji cDNA używane są zazwyczaj wektory genetyczne, które oprócz klonowania

umożliwiające również nadekspresję wklonowanych fragmentów.

4. Transformacja. Wybór organizmu gospodarza, do którego wprowadzamy bibliotekę cDNA zależy od sposobu, w jaki będziemy

przeprowadzać identyfikację poszczególnych klonów, np. E.coli - w przypadku hybrydyzacji kolonijnej.


  1. BAKTERIOFAG LAMBDA JAKO WEKTOR


Bakteriofag Lambda jest łagodnym bakteriofagiem E.coli o genomie wielkości około 48.5 kpz o znanej sekwencji. W cząsteczkach fagowych jego genom występuje jako liniowa, dwuniciowa cząsteczka z jednoniciowymi końcami komplementarnymi (nieco dłuższymi niż te otrzymywane po działaniu restryktaz). Końce te mogą hybrydyzować ze sobą.

Wykorzytuje się fakt, iż po zainfekowaniu komórki fag ten może przejść w cykl lizogenny, polegający na jego integracji z chromosomem bakteryjnym. Połączenie to jest stabilne, ale nietrwałe, gdyż nawet po wielu pokoleniach fag z cyklu lizogennego może przejść w lityczny.

Pojemność tego wektora waha się od 10-23 kpz (ta długość sprawia, że genom może zostać upakowany do kapsydu). Interesujący nas fragment wstawia się zamiast fragmentu wirusowego materiału genetycznego zbędnego dla cyklu życiowego wirusa – w miejsce oznaczone na rysunku jako dispensible, między dwa ramiona niezbędne wirusowi. Ramiona (o długości 9 oraz 19 kpz)te zawierają informacje niezbędne do namnażania faga. Konstrukty krótsze niż 10 kpz nie podlegają pakowaniu do kapsydu.

Skonstruowany wektor można łatwo zapakować do cząsteczek fagowych poprzez mieszanie DNA z białkami faga lambda In vitro (są to mieszaniny białek kapsydu oraz enzymów biorących udział w pakowaniu).

Proces pakowania zapoczątkowywany jest przez utworzenie konkatamerów przy udziale końców kohezyjnych (COS) położonych na zewnątrz ramion. DNA jest pakowany do kapsydów, gdy jest zachowany odpowiedni układ fragmentów (lewe ramię-insert-prawe ramię) i występuje odp. Odległość pomiędzy końcami COS.

Selekcji dokonujemy przy pomocy metody z łysinkami fagowymi (patrz wirusologia). Łatwe jest również przeglądanie łysinek i ich identyfikacja po hybrydyzacji z sondą.

Lambda ZAP: nie znalazłam dokładnie o co w tym chodzi, w każdym razie ten rodzaj jest bardzo przydatny do tworzenia bibliotek genowych ponieważ insert zawiera sekwencje inicjujące i terminujące replikację.

Zastosowanie: biblioteki cDNA, biblioteki DNA

Wadą jest stosunkowo mała pojemność (ale większa niż u plazmidów).

Zalety: wydajna transformacja przez infekcję, wstępna selekcja wielkości insertów

Klony - zbiór komórek lub organizmów będących swoimi wiernymi kopiami genetycznymi (innymi słowy: mającymi identyczny genotyp). Klony komórek powstają przez podział mitotyczny lub podział prosty (bakterie) jednej komórki (zobacz szczep monokloniczny), a organizmu w wyniku rozmnażania bezpłciowego z jednego organizmu macierzystego.

Określeniem klon nazywa się także organizm powstały przez klonowanie oraz identyczne fragmenty DNA skopiowane z jednej cząsteczki DNA (powstałe przy metodzie PCR).

  1. KOSMIDY


Kosmidy – sztucznie wytworzone wektory. Kosmidy tworzy się łącząc plazmidy z sekwencją cos bakteriofaga lambda. Dzięki temu tego rodzaju wektor zyskuje właściwości charakterystyczne zarówno dla plazmidu jak i dla faga. Dzięki sekwencji cos kosmidy przyjmują formę kolistą i replikują się jak plazmidy. Zrekombinowane kosmidy są pakowane w kapsydy faga lambda. W zainfekowanej komórce bakterii kosmid namnaża się, jednak w przeciwieństwie do faga nie niszczy jej. Replikacja kosmidów jest bardziej czasochłonna niż replikacja plazmidów (ze względu na duże rozmiary wprowadzonego obcego DNA), a liczba kopii kosmidów jest niższa niż plazmidów w danej komórce (od kilku do kilkunastu). Dzięki kosmidom możliwe jest klonowanie długich fragmentów DNA (do około 45 kb), na co nie pozwala użycie plazmidów. Poza tym muszą oczywiście zawierać miejsce inicjacji replikacji oraz gen oporności na antybiotyk.

Niestety mają stosunkowo niską stabilność. Tworzenie się konkatamerów cząstek wektora powoduje utratę insertu, wprowadzanie więcej niż 1 fragmentu obcego DNA, rekombinacja między fragmentami powtórzonego insertu, różnice szybkości podziałów klonów (prowadzi to do nadreprezentatywności lub zaniku sekwencji DNA w bibliotece)– wszystko to składa się na niską stabilność. Również przeglądanie bibliotek jest utrudnione. Biblioteki są przechowywane w postaci hodowli bakteryjnych (dodatkowa trudność). Przez to wektory kosmidowe nie zyskały dużej popularności.

Zaletą jest wydajna transformacja przez infekcję i stosunkowo duża pojemność.

Przygotowanie wektora kosmidowego: wektory kosmidowe są dostępne w postaci kolistej. Przed klonowaniem hydrolizuje się wektor enzymem restrykcyjnym w obrębie miejsca wielokrotnego klonowania (uwolnienie sekwencji COS). Fragmenty genomowego DNA są łączone z liniowymi cząsteczkami kosmidu. Rezultatem są długie cząsteczki hybrydowe, które po hydrolizie przez specyficzne nukleazy są pakowane do kapsydów faga lambda. Takie konstrukty wprowadza się do E.coli, gdzie podlegają replikacji tak jak plazmidy (oczywiście pod kontrolą miejsca inicjacji replikacji).

9. SZTUCZNE CHROMOSOMY DROŻDŻY YAC

Wektor ten umożliwia wkładanie fragmentów powyżej 100 kpz (nawet 700-1800 kpz). Można w nim umieszczać całe duże geny z genomowego DNA. Jest tak skonstruowany, że tworzy w komórce strukturę, która zachowuje się i namnaża jak chromosom. Może występować w formie kolistej lub liniowej.

Budowa: Wektory pYAC są tak zbudowane, że po hydrolizie EcoR1 i BamH1 powstają 2 ramiona, które mogą łączyć się z egzogennym DNA. Jedno z ramion zawiera miejsce inicjacji replikacji (ARS1), sekwencję centromerowi, gen markerowy syntezy tryptofanu i sekwencję telomerową. Drugie ramię zawiera gen markerowy syntezy uracylu i sekwencję telomerową.

Pierwotny wektor może być namnażany w E.coli ponieważ zawiera sekwencję inicjacji replikacji w pBR322 i gen oporności na ampicylinę.

Potem ramiona wektora wzbogacono o miejsca rozpoznawane przez restryktazy, promotory t7 i t3 i geny selekcyjne.

Wadą jest niska stabilność insertów oraz mało wydajna transformacja i izolacja. Ponieważ YAC dziedziczony jest jako pojedyncza kopia sygnał podczas przeglądania jest bardzo słaby (rozwiązuje się to przez konstrukcję „warunkowego centromeru”, którego funkcje w warunkach indukcyjnych są zakłócane przez wysoki poziom transkrypcji z promotora – dzięki temu liczba YACów rośnie. Jeśli ten promotor jest zablokowany to „warunkowy centromer” odzyskuje swoje funkcje i liczba kopii spada). Trudne jest również tworzenie wektorów z kilkoma różnymi insertami. Do ich rozdziału ponadto potrzebny jest aparat do elektroforezy w pulsacyjnym polu elektrycznym.

Zastosowania YACs: biblioteki genomowe




10. WEKTORY P1 I PAC


Wektor P1 (Bakteriofag P1):

  • Wielkość: 30 kpz

  • Zdolność przenoszenia fragmentów do100 kpz

  • Zalety: bardzo wysoka wydajność transformacji, wysoka stabilność insertów

  • Zastosowanie: biblioteki genomowe, transformowanie E.Coli szczepu Cre+

  • Zawiera sekwencję pac, która pozwala na pakowanie in vitro klonowanych fragmentów do otoczek faga

  • DNA pakowane do kapsydu fagowego i wprowadzane do E.Coli na zasadzie infekcji

  • Gospodarz E.Coli, liczba kopii: w fazie lizogennej pojedyncze, w fazie litycznej kilkadziesiąt

  • Wady: skomplikowane i mniej wydajne procedury klonowania

Wektor PAC:

  • Sztuczne chromosomy wyprowadzane z faga P1 – PAC

  • Wielkość: 19,5 kpz

  • Inserty o długości powyżej 140 kpz (do 150 kpz)

  • Zalety: duża pojemność i stabilność insertów

  • Zastosowanie: biblioteki genomowe

  • Poprawienie wydajności i precyzji klonowania poprzez usunięcie fragmentu wypełniającego P1, a w jego miejsce, w pozycji rozpoznawanej przez BamH1, wprowadzenie sekwencji Puc,

  • Przeglądanie biblioteki przez subklonowanie i losowe sekwencjonowanie powoduje zwiększenie frakcji klonów

  • Gospodarz: E.Coli, liczba kopii: kilka

  • Wady: duże rozmiaty wektora utrudniające przeglądanie biblioteki przez shotgun sequencing



11. SZTUCZNE CHROMOSOMY BAKTERYJNE BAC

BAC ( bacterial artificial chromosome)- jest zrekombinowanym DNA bazującym na DNAplazmidowym Escherichia coli, używanym w inżynierii genetycznej jako wektor do klonowania DNA.

Wykazuje zdolność do przyjęcia fragmentów DNA do klonowania długości 100-350kpz. Wektor jest oparty o dobrze opisany czynnik płci F E.coli. Jest to duża cząsteczka utrzymująca się w kolejnych pokoleniach bakterii w postaci jednej lub dwóch kopii. BAC zawiera:

- miejsce dla replikacji (oriS)

-loci dla prawidłowego rozdziału (parA, parB) –utrzymują liczbę kopii na poziomie jednej/dwóch na komórkę, zabezpieczając wektor przed wzajemnymi rekombinacjami

- miejsce do przyłączania DNA polimerazy (repE)

- gen oporności na chloramfenikol(CMR)

- cosN – miejsce cos dla faga lambda

-sekwencję loxP z bakteriofaga P1

-HindIII i BamHI- miejsce wstawiania obcego DNA, oba promotory są przeznaczone do transkrypcji wstawionych fragmentów DNA

-NotI jest przeznaczone do wycinania wstawionych fragmentów.

Miejsce klonowanie jest oskrzydlone przez promotory T7 i SP6 wykorzystywane do uzyskiwania son RNA przydatnych w mapowianiu fragmentów. Sekwencje cos i loxP mogą być hydrolizowane przez specyficzne enzymy( terminaza faga lambda, rekombinaza cre faga P1) generując fragmenty przydatne w mapowianiu restrykcyjnym. W dalszych modyfikacjach wektory BAC zostały uzupełnione o łącznik pUC i gen selekcyjny sacB.

Wektory BAC zawierające inserty długości powyżej 300 kpz są w wydajny sposób wprowadzane do bakterii przez elektroporację.Potwierdzony jest niski poziom rekombinacji i pojawiania się klonów chimerowych przez więcej niż 100 pokoleń.BAC wykazuje wysoką stabilność insertu oraz łatwość operacji namnażania i izolacji klonu.

Biblioteki genomowe w wektorach BAC były konstruowane dla szeregu roślin. Wektory te zostały także użyte do konstrukcji bibliotek wykorzystywanych w projekcie sekwencjonowania genomu człowieka.







Rodzaj wektora

wielkość

pojemność

Liczba

kopii

gospodarz

stabilność

zastosowanie

wady

zalety

BAC

7,4 kpz

100-350*

kpz

1 – 2

E.coli

Bardzo wysoka

Biblioteki genomowe

Pojemność mniejsza od YAC

Duża stabilność insertów

YAC

11 kpz

700-1800kpz

pojedyncza

S.cerevisiae

niska

Biblioteki genomowe

Niska stabilność insertów,

mało wydajna transformacja i izolacja

Bardzo duża pojemność

























Sztuczne chromosomy drożdżowe (YAC)

Wektor YAC jest wektorem bifunkcjonalnym, ponieważ jest zdolny do powielania w komórkach

bakterii i drożdży. S. cerevisiae to organizm dobrze scharakteryzowany metodami

fizjologicznymi i biochemicznymi, który jest hodowany w warunkach in vitro na dużą skalę,

m.in. dla potrzeb przetwórstwa żywności, ponieważ nie wytwarza toksyn, a hodowle nie ulegają

zakażeniom wirusowym. Sekwencje „drożdżowe” centromeru (CEN 4), telomeru (TEL)

i miejsca początku replikacji (ARS) zostały wyizolowane i połączone z plazmidami skonstruowanymi

dla E. coli. Sekwencja TEL stanowi część DNA, która w komórkach drożdży

wydłużana jest przez enzym telomerazę. Sekwencja CEN 4 funkcjonuje prawidłowo podczas

segregacji chromosomów S. cerevisiae w procesie mitozy. Sekwencja ARS pełni role miejsca

początku replikacji, podobnie jak sekwencja ori u bakterii. Chociaż w wektorach YAC można

klonować bardzo długie odcinki DNA, często okazuje się, że klonowane inserty zawierają

nieciągłe sekwencje, przez co są niestabilne.





* a nawet do 500 kpz (inne źródło :P )

Ch9A7

Klonowanie przy pomocy wektora YAC



12. WKTORY DO TRANSFORMACJI ROŚLIN


Jednym z podstawowych zastosowań bibliotek genomowych jest pozyskiwanie i analiza nowych genów. Odbywa się to przez klonowanie pozycyjne, polegające na oznaczaniu markerów DNA blisko sprzężonych a badanym genem, a następnie izolacji z bibiloteki genomowej dużego fragmentu pokrywającego się z markerami. Ostatecznie poznananie sekwencji genu odbywa się przy użyciu techniki „spaceru po chromosomie”. Dowodem na prawidłową identyfikację poznanego genu jest dopiero test komplementacji, w którym mutanta pozbawionego aktywności badanego genu transformuje się jego dzikim allelem.


Wprowadzenie dużego genu eukaryotycznego do komórek bakteryjnych, drożdży i zwierząt nie stanowi w tej chwili problemu. Większe trudności sprawia wydajna transformacja komórek roślinnych. Skonstruowane systemy opierające się o wektory kosmidowe i typu lambda pozwalały na konstrukcje bibliotek o wielkości 5-25 kpz. Taka pojemność wektorów ogranicza możliwości izolacji genów przez mapowanie pozycyjne.


Znane są metody wykorzystujące wirusowe genomy i ich do zdolność infekcji komórek. Metody te mają istotne ograniczenia. Po pierwsze niektóre wirusy są patogenne, po drugie za pomocą wirusa można wprowadzać tylko niewielkie fragmenty DNA i, co równie istotne, przeniesiony tą drogą DNA nie jest przekazywany potomstwu. Możliwe jest także wprowadzanie bezpośrednio obcego DNA do komórek roślinnych, wiąże się to jednak z otrzymywaniem protoplastów , a następnie regenerowaniem z nich rośliny co możliwe jest tylko w przypadku niektórych gatunków.


Rozwój nowych typów wektorów charakteryzujących się dużą pojemnością doprowadził do opracowania systemów pozwalających na transformację roślin fragmentami DNA przekraczającymi 100 kpz.


Jeden z systemów opiera się na użyciu tzw. sztucznego chromosomu zdolnego do transformacji (TAC), który może być replikowany zarówno w komórkach E. coli jak i Agrobacterium tumefaciens.

Wektor TAC został skonstruowany na bazie wektora P1 (zawiera replikony P1, plazmidowy i lityczny oraz gen sacB kodujący enzym transferazę sacharylo-6-fruktozową). Posiada także replikon plazmidu Ri – pR i A4, prawą i lewą sekwencję graniczną T-DNA (Rb i Lb) ze znajdującym się pomiędzy nimi promotorem synteteazy napolinowej Pnos, region kodujący geny fosfotransferazy higromycynowej HPT i nos 3’-sygnał poliadenylacji genu syntetazy napolinowej.


Drugi system opracowany przez Hamiltona i jego współpracowników to tzw. binarny system BAC (BIBAC). Wykorzystuje on wektory BAC, do których wprowadzono prawą i lewą sekwencję graniczną T-DNA (Rb i Lb) oraz geny markerowe beta-glukoronidazy GUS, fosfotransferazy neomycynowej i oporności na higromycynę oraz miejsce inicjacji repilkacji plazmidu Ri. Dodatkowo stosuje się plazmid pomocniczny pcH zawierający geny wirulencji A, tumefaciens, vir G, vir E1 i E2.


13. KLONOWANIE


Klonowanie- proces tworzenia idealnej kopii z oryginału. Termin klonowanie jest używany w kilku znaczeniach. W biologii mianem klonu określa się organizmy mające identyczny lub prawie identyczny materiał genetyczny. Klonami są organizmy powstałe w procesie rozmnażania wegetatywnego- bakterie, jednokomórkowce, odrośla i rozmnóżki roślin itp. Klonowanie to proces tworzenia organizmów mających taką samą informację genetyczną jak dawca:

- klonowanie organizmów

- klonowanie genów

Terminy klon i klonowanie wprowadził do biologii J.B.S Haldane na określeni procesu i produktu transferu jądrowego zastosowanego w pionierskich doświadczeniach przez Johna Gurdona.


Klonowanie organizmów- oznacza procedurę otrzymywania organizmów o takiej samej inf. genetycznej, z reguły poprzez procedurę transferu jądra z komórki somatycznej do komórki jajowej pozbawionej uprzednio jądra. W przypadku klonowania roślin stosuje się procedurę odróżnicowania komórek dawcy do komórek merystematycznych. Szczególnym przypadkiem jest twinning, czyli powstawanie lub otrzymywanie bliźniąt jednozygotycznych, gdzie nie można wyróżnić dawcy.


Klonowanie genów- w genetyce i biologii molekularnej proces izolowania genu. Polega na łączeniu fragmentów materiału genetycznego z wektorem molekularnym i ich namnożeniu w innym organizmie. Otrzymuje się w ten sposób wiele kopii tego samego genu. Termin klonowanie odnosi się też do identyfikacji genów. Jeżeli pojedynczy fragment genomu jest przenoszony z jednego wektora do drugiego, taki proces określa się mianem subklonowania.


Etapy pracy

Klonowanie przebiega w następujących etapach:

- początkowo pobiera się komórki somatyczne od jednego organizmu, po czym hoduje się je na pożywce

- pobranie komórki jajowej z drugiego organizmu i również hodowanie jej w warunkach in vitro wraz z komórkami somatycznymi, tak by zsynchronizować cykle komórkowe obu typów komórek i zatrzymać je w fazie G0 cyklu komórkowego

- usunięcie jądra komórkowego z komórki jajowej

- połączenie "pustej" komórki jajowej z jądrem komórki somatycznej poprzez elektrofuzję

- powstanie zarodka in vitro i rozpoczęcie podziałów komórkowych

- implantacja zarodka do macicy matki zastępczej


Przeniesienie jądra komórki somatycznej:

Opanowano obecnie metody klonowania wielu gatunków roślin i zwierząt. W przypadku zwierząt zazwyczaj stosuje się technikę, polegającą na przeniesieniu jądra kom.somatycznjej pobranej z klonowanego osobnika, do kom.jajowej pozbawionej jądra. Proces ten tworzy funkcjonalną zygotę. Zygota ta może jeśli się na to pozwoli rozwinąć w żywego osobnika. Dawca komórki jajowej z reguły pochodzi z tego samego gatunku. Transfer jądra do kom. jajowej innego gatunku rzadko jest skuteczny.


Klonowanie somatyczne:

Dojrzały oocyt Hodowla fibroblastów



Enukleacja Transekcja DNA



enukleowany oocyt Hodowla fibroblastów transfekowanych


weryfikacja



Transfer transgenicznego fibroblastu i fuzjaKrótkotrwała hodowla zarodkaWprowadzenie zarodka do przygotowanej hormonalnie matki zastępczejNarodziny transgenicznie sklonowanego zwierzątka z wprowadzonym genem.


Klonowanie zwierząt:

Owca 1996- pierwszy sklonowany ssak powstały z dojrzałej komórki gruczołu mlekowego.

Małpa (rezus) samica,styczeń 2000

Świnia ( 5 prosiaków, Szkocja 2000)

Bawól samiec,styczeń 2001

Krowa samica 2001

Kot CapyCat „CC”,jesień 2001

Jeleń Dewey 20003

Szczur 2003


Produkty PCR

Możemy wyróżnić trzy podstawowe warianty klonowania produktów PCR. Pierwszy zakłada wykorzystanie do amplifikacji genu starterów modyfikowanych zawierających na końcu 5’ oprócz sekwencji komplementarnych do amplifikowanego genu sekwencje miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne oraz kilka dodatkowych, przypadkowych nukleotydów. Powinny to być miejsca restrykcyjne, które występują w MCS, a nie występują w obrębie amplifikowanego genu. Dodatkowe nukleotydy są wymagane przez niektóre enzymy restrykcyjne do prawidłowego działania. Po oczyszczeniu produktów PCR od składników mieszaniny reakcyjnej (dNTP, sole, startery, polimeraza) hydrolizuje się je odpowiednimi endonukleazami, najczęściej pozostawiającymi lepkie końce, co poprawia wydajność ligacji i redukuje tło, ponownie oczyszcza i liguje z wektorem plazmidowym przygotowanym w ten sam sposób.

Drugi i trzeci wariant klonowania dotyczy produktów PCR nie zawierających dodatkowych miejsc restrykcyjnych i zależy od typu zastosowanej do amplifikacji polimerazy. W zależności od jej typu, produkt PCR będzie posiadał albo tępe końce, albo końce 3’ z dodatkową terminalną adeniną. Ten drugi przypadek jest spowodowany dodatkową aktywnością niektórych polimeraz, aktywnością terminalnej transferazy. Takie polimerazy dołączają dodatkowe pojedyncze A do końców 3’. Dzięki temu do klonowania możemy wykorzystać komercyjnie dostępne zestawy do klonowania, w skład, których wchodzi wektor, który na końcach 5’ posiada komplementarną resztę T. W praktyce mieszanina fragmentów DNA, którą jest produkt PCR zawiera zarówno fragmenty z dołączoną resztą A jak i fragmenty bez reszty A.

Przygotowanie fragmentu DNA

Materiałem wyjściowym do klonowania jest najczęściej wysokocząsteckzowy DNA, dlatego pierwszy krok polega na przygotowaniu krótszych fragmentów DNA za pomoca metod fizycznych lub enzymatycznych. Wśród fizycznych dominuje mechaniczna fragmentacja DNA przez działanie ultradźwiękami lub stosowanie wysokiego ciśnienie. Metody te powoduja szereg niedogodności, wielkośc uzyskanych fragmentów kontrolowana jest jedynie przez intensywność i czas trwania sonikacji lub wielkość ciśnienia.Znacznie częściej stosowana jest hydroliza DNA enzymami endonuklelitycznymi.

Enzymy restrykcyjne rozpoznają specyficzne sekwencje DNA i hydrolizują 2-niciową cząsteczkę DNA w ściśle określonym miejscu, w obrębie lub okolicy sekwencji rozpoznawanej. DNA hydrolizowany enzymami restrykcyjnymi można trwale połączyć za pomocą ligazy DNA z samoreplikującą się cząsteczką DNA, np. wektorem plazmidowym.


Ligacja

DNA plazmidu i wprowadzanego fragmentu sa kowalencyjnie łączone przez ligazę DNA, katalizującą tworzenie wiązań fosfodiestrowych w miejscach zerwania łańcucha DNA. Ligaza DNA potrzebuje wolnej grupy 3’-hydroksylowej oraz ufosforylowanej grupy 5’-OH.Wymaga również,aby łączone odcinki DNA znajdowały się w obrębie dwuniciowej helisy.Energia potrzebna do reakcji ligacji(łączenia) pochodzi z ATP lub NAD+.

Metoda łączenia DNA przez końce kohezyjne ma zastosowanie dzięki stosowaniu chemicznie syntetyzowanych krótkich łączników DNA (linkerów),które mogą być rozcinane przez enzymy restrykcyjne. Najpierw łącznik zostaje kowalencyjnie przyłączoy do końca fragmentu DNA lub wektora. Np. końce 5’ dekamerycznego linkera i cząstki DNA poddaje się fosforylacji za pomocą kinazy polinukleotydowej a następnie łączy za pomocą ligazy z faga T4.Ligaza z faga T4 może kowalencyjnie łączyć fragmentu dwuniciowego DNA mające tzw,tępe końe.


Wrowadzenie do bakterii:

Bez względu na zastosowaną metodę klonowania zrekombinowany wektor plazmidowy wprowadzany jest do bakterii najczęściej w procesie transformacji. Zdolność do pobierania „nagiego” DNA, czyli takiego, który nie jest związany z żadnym nośnikiem, jest zjawiskiem naturalnie występującym u wielu drobnoustrojów. Stan, w którym drobnoustroje muszą się znajdować, aby być zdolne do pobrania DNA nazywamy kompetencją. Stan kompetencji nie występuje w sposób naturalny u najczęściej wykorzystywanych w procesie klonowania bakterii E. coli. Stąd też istnieje konieczność wprowadzenia tych bakterii w stan kompetencji w sposób sztuczny. Błona komórkowa bakterii E. coli, zebranych w fazie wzrostu logarytmicznego, w momencie gdy gęstość optyczna hodowli osiąga wartość OD600 = 0.5-0.7, pod wpływem niskiej temperatury i dużego stężenia dwuwartościowych kationów staje się przepuszczalna. W typowej procedurze na komórki działa się roztworem chlorku wapnia.

Wydajność transformacji, zależy od szeregu czynników, takich jak szczep bakterii, forma wektora plazmidowego (liniowa lub kolista), jego wielkość oraz stopień oczyszczenia, a także warunki hodowli i sposób przechowywania kompetentnych bakterii.


Selekcja

Bakterie które przyjęły plazmid sa selekcjonowane na pożywce zawierającej antybiotyk.Jest to możliwe ponieważ w wektorze znajduje się gen nadający bakteriom oporność na zastosowany antybiotyk.Selekcję zazwycza uzyskuje się dwoma sposobami. Pierwszy z nich wykorzystuje obecność w plazmidzie genu oporności na antybiotyk np. β-laktazamzy,nadającego odporność na ampicylinę. Selekcję odpowiednim antybiotykiem przeżyją tylko komórki, które pobrały plazmid.

Drugi sposób to system selekcji opierający się na tzw. teście α-komplementacji, wykorzystującym elementy genetyczne operonu lac. Na odpowiedniej pożywce bakterie, które pobrały rekombinowany plazmid będą miały zabarwienie białe, w odróżnieniu od niebieskiego zabarwienia bakterii, które pobrały plazmid nierekombinowany. Efekt barwny pojawia się w wyniku aktywności β-galaktozydazy, enzymu powstałego w wyniku komplementacji dwóch podjednostek, z których dużą podjednostkę ω koduje gen ΔlacZM15 znajdujący się w chromosomie bakteryjnym, a małą podjednostkę tzw. α-peptyd koduje gen lacZ, znajdujący się w wektorze plazmidowym. Enzym β-galaktozydaza, którego aktywność zostaje odtworzona w wyniku połączenia się obu podjednostek rozkłada obecny w pożywce substrat – dwucukier X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopiranozyd) - na dwa cukry składowe, z których jeden ma niebieską barwę. Ponieważ MCS znajduje się w obrębie genu lacZ, wprowadzenie wstawki do wektora będzie skutkowało przerwaniem ciągłości genu kodującego podjednostkę α, a co za tym idzie uniemożliwi powstanie funkcjonalnego enzymu. W takim przypadku nie pojawi się również efekt barwny.


Odzyskanie klonowanego DNA ?

Tradycyjną procedurę oczyszczania produktu PCR polegającą na ekstrakcji fenolem/chloroformem oraz wytrącaniu etanolem przeżywa niewielka ilość aktywnej polimerazy Taq. Polimeraza Taq jest tylko czasowo inaktywowana przez silne czynniki denaturujące. Po zawieszeniu osadu w buforze jest zdolna do reaktywacji swojej aktywności. Procedurę może przetrwać również niewielka frakcja nieuszkodzonych nukleotydów. W konsekwencji może to prowadzić do niepożądanego wypełniania lepkich końców, a co za tym idzie obniżenia wydajności ligacji a w niektórych przypadkach nawet uniemożliwia klonowanie. Dlatego w przypadku produktu PCR przeznaczonego do klonowania stosujemy metodę oczyszczania z zastosowaniem kolumienek ze złożem specyficznie wiążącym kwasy nukleinowe. Jest to metoda droższa, ale skutecznie usuwa startery, polimerazę, nukleotydy i sole, jest prosta i szybka. Jednocześnie unikamy stosowania potencjalnie szkodliwych dla zdrowia i środowiska rozpuszczalników organicznych.


14. MODYFIKACJA KOŃCÓW DNA DLA POTRZEB KLONOWANIA


Najważniejszą cehcą enzymów restrykcyjnych jest rozpoznawanie specyficznych sekwencji w dwuniciowym DNA, co w efekcie prowadzi do powstania ściśle określonych fragmentów DNA zarówno pod względem długości, jak i struktury końców. Nacięcie obydwu nici w dwuniciowym DNA przez enzym wzdłuż jednej osi symetrii powoduje powstanie fragmentów o tzw. tępych końcach. Często jednak hydroliza następuje wzdłuż podwójnej osi symetrii; w rejonie nacięcia powstają wtedy dwa komplementarne, jednoniciowe końce, zdolne do odtworzenia struktury dwuniciowej, tzw. lepkie końce.

W praktyce do formowania lepkich końców stosować można sześć różnych metod:

1) Formowanie i łączenie lepkich końców z zastosowaniem jednej restryktazy ( w ten sposób tworzą się dwa identyczne komplementarne końce) – łączenie ligazą


2) Hydroliza różnymi enzymami restrykcyjnymi, ale wykonującymi nacięcie w obrębie tych samych sekwencji, dzięki czemu uzyskujemy końce komplementarne – łączenie ligazą


3) Fromowanie tępych końców przez wypełnianie lepkich końców, przy użyciu polimerazy DNA i wolnych nukleotydów (następnie ich łączenie z użyciem ligazy)


4) Formowanie komplementarnych lepkich końców przez częściowe wypełnienie lepkich końców niekomplementarnych do siebie (z użyciem polimerazy DNA i wolnych dNTP)


5) Ligacja DNA z synteteycznymi łącznikami zawierającymi miejsca restrykcyjne – do cząsteczki DNA na jej obu końcach przyłączane są krótkie fragmenty DNA (łączniki), których sekwencja rozpoznawa jest przez restryktazę, która formuje z nich lepkie końce


6) Lączenie lepkich końców za pomocą syntetycznych adapterów – adapterem jest syntetyczna cząsteczka DNA, która na obu końcach posiada lepkie końce komplementarne do końców, które posiadają fragmenty DNA jakie chcemy połączyć


15. ENZYMY RESTRYKCYJNE

Definicja

Odkrycie enzymów restrykcyjnych spowodowało ogromny rozwój technik stosowanych w biologii molekularnej. Enzymy restrykcyjne są to enzymy z grupy endonukleaz, które przecinają nić DNA w miejscu wyznaczanym przez specyficzną sekwencję DNA. Enzymy restrykcyjne powszechnie występują np. U bakterii stanowiąc element systemu modyfikacji i restrykcji, chroniąc komórkowy genom przed wnikaniem obcego genomu.

Rozpoznawana sekwencja ma z reguły od czterech do ośmiu par zasad.

Trzy klasy enzymów restrykcyjnych

Klasa I – enzymy restrykcyjne zbudowane z wielu podjednostek, zawierają aktywnosci metylazy i restryktazy. Przecinają DNA z dala od rozpoznawanej sekwencji, dlatego nie mają większego znaczenia praktycznego.

Klasa II – przecinają DNA w zdefiniowanym miejscu, w obrębie rozpoznawanej sekwencji, składają się z pojedyńczych polipeptydów. Mają największe znaczenie w manipulacjach z DNA

Klasa III – duże kompleksy białkowe, wymagające dwóch sekwencji rozpoznawanych w pobliżu siebie. Nie mają znaczenia praktycznego.

Podział restryktaz ze względu na rozpoznawaną sekwencję:

czwórkowe - rozpoznają czteronukleotydową sekwencję DNA; w cząsteczkach DNA jest wiele takich miejsc, średnio co 256 bp, dlatego tego rodzaju enzymy restrykcyjne trawią DNA na bardzo małe fragmenty;

szóstkowe - rozpoznają sekwencję DNA o długości sześciu nukleotydów; w cząsteczce DNA zawierającej równe ilości poszczególnych nukleotydów, takie miejsca restrykcyjne pojawiają się statystycznie co około 4096 bp, ale procentowe zawartości nukleotydów w DNA są różne w różnych organizmach, dlatego znalezienie odpowiedniego enzymu szóstkowego oraz warunków przeprowadzanej reakcji wymaga przeprowadzenia wstępnych eksperymentów;

ósemkowe - stosowane są niezbyt często, ponieważ cząsteczki DNA zawierają niewiele miejsc podatnych na działanie takich enzymów.

Inny podział enzymów restrykcyjnych

Klasa I – białka multimeryczne wymagające jako kofaktorów ATP, S-adenylometioniny i Mg2+

działają zarówno jako restryktazy oraz kodyfikacyjne metylazy

substrat to dwuniciowy DNA zawierający zdefiniowaną sekwencję kilkunastu nukleotydów

enzym rozpoznaje sekwencje i w pewnej odległości od niej nacina obie nici DNA, nie

uzyskuje się ściśle określonych fragmentów DNA

Klasa II – białka proste, występują w postaci dimerów i tetramerów, in vitro aktywowane Mg2+

odpowiadające im metylazy występują jako oddzielne białka monomeryczne

substratem jest dwuniciowy DNA zawierający kilku nukleotydową sekwencje specyficznie

rozpoznawaną przez dany enzym

cięcie obu nici zachodzi w obrębie tej rozpoznanej sekwencji lub jej pobliżu (klasa IIS)

większość enzymów rozpoznaje palindromowe sekwencje (posiadające oś symetrii) cztero-,

sześcio-, lub ośmionukleotydowe. W wyniku ich cięcia mogą powstać dwa rodzaje końców

tzw „lepkie” i „tępe” końce

enzymy te znalazły największe zastosowanie w biologii molekularnej

Klasa III – aktywowane przez jony Mg2+ i ATP, czasem potrzebna jest S-adenylometionina.

Aktywność restryktaz zależy także od stężenia soli (NaCl) zawartej w buforze. Niektóre enzymy

wykazują maksimum aktywności przy wysokim stężeniu soli (150 mM), inne przy niskim stężeniu NaCl.

Są również takie dla których stężenie soli może być skrajnie różne (0-150 mM) np. AvaI.

Wszystkie enzymy restrykcyjne po trawieniu dwuniciowego DNA pozostawiają grupę

fosforanową na końcu 5', a grupę hydroksylową na końcu 3'.

Wydaje się, że przecięcie dwóch nici w obrębie rozpoznanej sekwencji nie zachodzi jednocześnie,

lecz jest wynikiem dwóch niezależnych reakcji katalitycznych. Stosując odpowiednio niskie stężenie

enzymu w stosunku do stężenia DNA można uzyskać cząsteczki z tylko jedną przeciętą nicią.


Nomenklatura

Nazwy enzymów z reguły są tworzone od pierwszej litery nazwy rodzajowej i dwóch pierwszych liter nazwy gatunkowej, pisanymi kursywą. Po nich może wystąpić kilka liter lub cyfr arabskich oznaczających szczep bakterii. Nazwa zakończona jest rzymską cyfrą oznaczającą, jako który kolejny enzym został on wyizolowany z danego szczepu.

  • BamH I - pierwszy enzym wyizolowany z Bacillus amyloliquefaciens szczepu H.

  • Sma I - pierwszy enzym wyizolowany z Serratia marcescens szczepu Sb (nazwa szczepu została pominięta w nazwie enzymu).

  • NgoM IV - czwarty enzym wyizolowany z Neisseria gonorrhoeae szczepu MS11.

  • Sex I - enzym wyizolowany z Streptomyces exfoliatus.

  • Uba 58 I - enzym wyizolowany z niezidentyfikowanej bakterii (Unidentified bacterium) RFL58. Rozpoznawane sekwencje ( przykłady )

Ważne pojęcia:

Izoschizomery: enzymy restrykcyjne, różniące się sekwencją swojego polipeptydu i pochodzące z odmiennych organizmów, a rozpoznające tę samą sekwencję DNA i przecinające DNA w takim samym miejscu nazywamy izoschizomerami. Interesującą własnością izoschizomerów jest to, że pomimo tej samej specyficzności substratowej, z reguły mają zupełnie odmienną sekwencję i strukturę trzeciorzędową. Wskazuje to na ich osobne pochodzenie ewolucyjne.

Praca z enzymami: enzymy restrykcyjne wymagają do działania jonów dwuwartosciowych.

Jednostka U: Jeden U to ilość enzymu katalizująca przemianę 1μmola substratu w czasie 1 minuty. Zwykle przyjmuje się określone warunki: temperaturę 30°C, dane pH i maksymalne wysycenie enzymu substratem.


19. GENY REPORTEROWE I MARKEROWE


GEN MARKEROWY - gen wyznacznikowy, każdy gen, którego funkcja oraz położenie w chromosomie są znane; dowolna genetycznie kontrolowana cecha fenotypowa, wykorzystywana do celów analizy genetycznej, dowolna różnica genetyczna wykorzystywana dla ujawnienia wypadków rekombinacji. Ułatwia rozpoznanie nowego zrekombinowanego genotypu na podstawie sposobu, w jakim ujawnia się zewnętrznie(służą do rozróżnienia komórek transformowanych wśród nietransformowanych np. gen kodujący βgalaktozydazę). Zaliczamy do nich:

1. Markery selekcyjne.

Chronią komórkę przed działaniem szkodliwego czynnika. Po zastosowaniu substancji selekcyjnej na hodowlę, wzrost podejmą tylko te komórki, które posiadają gen markerowy, a tym samym pożądany fragment DNA. Najczęściej stosowanymi związkami selekcyjnymi są antybiotyki (zwłaszcza w przypadku bakterii i roślin). Tego typu zabiegi są również stosowane do oceny czy organizmy potomne nie utraciły interesującego nas genu. Po dodaniu antybiotyku, przeżyją te z zachowanym genem.

Przykłady:

  • fosfotransferaza II neomycyny (NPT II)

3’-fosfotransferaza II aminoglikozydów jest najszerzej stosowanym w transformacji roślin markerem selekcyjnym. Enzym kodowany przez gen nptII inaktywuje przez fosforylację dużą ilość antybiotyków aminoglikozydowych, takich jak: kanamycyna, neomycyna, paromycyna. Najczęściej stosowana jest kanamycyna. Na pożywce zawierającej odpowiednie antybiotyki wyrosną tylko rośliny zawierające gen nptII.

  • Fosfotransferaza hygromycyny (działa podobnie jak NPT II , celem jest hygromycyna)

  • Acetylotransferaza gentamycyny (działa podobnie jak poprzednie, ale inaktywacja zachodzi na drodze acetylacji antybiotyku.)

  • Fosfotransferaza streptomycyny (SPT)

Streptomycyna w przypadku roślin nie powoduje śmierci komórek, tylko ich blaknięcie, podczas gdy komórki odporne pozostają zielone (gen kodujący SPT używany jest także jako gen reporterowy)

  • Odporność na bleomycynę

Komórki roślin nie posiadają naturalnej odporności na ten glikopeptydowy antybiotyk. Powoduje on powstawanie przerw w jedno i dwuniciowym DNA. W celu zapewnienia oporności stosuje się geny kodujace BBP (bleomycin binding protein).


2. Markery różnicujące:

Powodują zmianę w wyglądzie komórek transformowanych np. zmiana zabarwienia kolonii, emisja światła. Przykłady:

  • β-galaktozydaza

Enzym katalizuje hydrolizę β-galaktozydów do monosacharydów. Pochodzi z bakterii Escherichia coli, kodowany przez gen lacZ. Jest najczęściej stosowanym markerem różnicującym w genetyce molekularnej. W wektorze używanym do transformacji znajduje się N-końcowy fragment genu lacZ. Natomiast w organizmie biorcy fragment C-końcowy. W wyniku współdziałania obu elementów powstaje w pełni aktywny enzym. W eksperymencie transformacji interesujący nas fragment DNA jest umieszczany w obrębie sekwencji N-końcowej genu lacZ co automatycznie powoduje jego uszkodzenie. Aby wykryć w komórkach obecność enzymu umieszcza się je na pożywce zawierającej X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolylo-β-D-galaktozyd), w przypadku obecności ß- galaktozydazy zaobserwujemy pojawienie się niebieskiego produktu (4-chloro-3-bromo-indygo) powstałego w wyniku cięcia X-gal, oznacza to, że biorca przyjął plazmid, ale pusty (bez insertu). Jeśli niebieski produkt nie powstanie można wnioskować, że bakteria pobrała plazmid ze wstawką.

  • Białko zielonej fluorescencji (GFP)

Wyizolowane z meduzy Aequorea victoria, kodowane przez gen gfp. Własności bioluminescencyjne związane są
z występowaniem we wnętrzu białka chromoforu zbudowanego z sześciu reszt aminokwasowych : N - Phe64 - Ser - Tyr - Gly - Val - Gln69 - C z czego kluczową rolę odgrywają ulegające autokatalitycznej cyklizacji reszty Ser65-Tyr66-Gly67.
In vivo fluorescencja zachodzi na drodze dostarczenia energii przez fotoproteinę aktywowaną jonami wapnia, ale w warunkach laboratoryjnych w celu indukcji świecenia stosuje się światło UV. Obecnie w handlu dostępne są gotowe plazmidy z genem gfp jako markerem wystarczy, więc w takim wektorze umieścić żądaną wstawkę i dokonać transformacji bakterii. W celu identyfikacji transformantów stosuje się światło UV, kolonie zmodyfikowane będą świecić na jasnozielony kolor. Omawiany gen może być także markerem w organizmach roślin
i zwierząt.


GENY REPORTEROWE (gen kodujący białko, którego obecność lub aktywność biochemiczną można
w łatwy sposób oznaczyć
in vivo np. badanie aktywności promotora przez poziom ekspresji genu kodującego Bgalaktozydazę, mogą być użyte do rozróżniania kolonii).


Nie powodują odporności komórek transformowanych na szkodliwe związki chemiczne. Mogą działać na podobnej zasadzie co markery różnicujące, częstymi są także przypadki w których pewne geny ( np. gfp , lacZ) można by zaliczyć do obu grup. Gen reporterowy jest łączony z sekwencją która ma być badana np. potencjalne miejsca promotorowe, otwarte ramki odczytu . Koduje on białko, które może być wykryte bezpośrednio ( np. emisja światła), lub jego aktywność jest rozpoznawana w wyniku reakcji enzymatycznej prowadzącej do powstania łatwo wykrywalnego produktu ( np. zmiana koloru) Dany gen może zostać zastosowany w badaniach, jedynie gdy określona komórka/kolonia nie posiada genów kodujących białko homologiczne do tego użytego jako reporter.


W wyniku wzrostu aktywności badanej sekwencji ( np. uaktywnienie promotora) następuje ekspresja genu reporterowego kodującego odpowiednie białko, a aktywność białka mierzy się za pomocą technik:

  1. Autoradiograficznych

  2. Spektrofotometrycznych

  3. Chemi- i bioluminescencyjnych

Im wyższa aktywność - tym większa produkcja białka a w związku tym silniejszy sygnał.


Cechy dobrego genu reporterowego:

  1. Produkt powinien być łatwo wykrywalny

  2. Powinna istnieć metoda ilościowego oznaczenia aktywności białka kodowanego przez ten gen

  3. Aktywność powinna być wykrywana in situ w czasie rzeczywistym

  4. Próby wykrywania aktywności nie powinny być związane ze zniszczeniem próbki


Przykłady genów reporterowych:

  • GFP

Białko to może zostać użyte jako reporter, w celu badania aktywności określonych promotorów. Ze względu na bogatą paletę barw, stabilność i znikomą toksyczność jest najczęściej stosowanym genem reporterowym.

  • β-galaktozydaza

  • Lucyferaza

Enzym kodowany przez geny luc, występujące między innymi u robaczka świętojańskiego, jamochłona morskiego lub bakterii. Katalizuje bioluminescencyjną reakcję przemiany substratu – lucyferyny, która w obecności ATP, jonów Mg2+ oraz tlenu cząsteczkowego ulega utlenieniu i przechodzi w stan wzbudzenia, a następnie – powracając do stanu wyjściowego – powoduje emisję światła. Emitowane fotony są zliczane przy pomocy luminometru. Całkowita emisja światła jest wprost proporcjonalna do aktywności lucyferazy w badanej próbce i pozwala na oszacowanie aktywności transkrypcyjnej genu reporterowego. Geny lucyferazy wykorzystuje się do badania ekspresji genów w pojedynczych komórkach (roślinnych i zwierzęcych) i całych organizmach, nie powodując ich zniszczenia.

  • Β-glukuronidaza ( GUS )

Enzym kodowany przez gen bakteryjny, często wykorzystywany w badaniu ekspresji genów roślin, ze względu na bardzo niskie tło, łatwy pomiar ilościowy, wysoką specyficzność (zmniejszenie wartości błędu pomiarowego) oraz wysoką czułość. Istnieje możliwość wykorzystania genu ”GUS” u roślin, pomimo obecności w nich genu homologicznego. Optymalne pH dla enzymu bakteryjnego jest znacznie wyższe niż w przypadku enzymu endogennego. GUS może być także wykorzystywany do badania alg, grzybów i większości bakterii. Powszechnie stosowanym substratem w oznaczaniu aktywności biochemicznej GUS jest X-gluc (5- bromo-4-chloro-3-indolylo- β-D-glukuronid), a sama reakcja przebiega analogicznie, jak w przypadku β galaktozydazy.

  • Acetylotransferaza chloramfenikolu (CAT)

Kodowana przez gen cat jest jednym z najszerzej i najczęściej stosowanym genem reporterowym
w komórkach eukariotycznych (są one praktycznie pozbawione są enzymów, które mogą z nim współzawodniczyć) Enzym prokariotyczny katalizuje przeniesienie grup acetylowych z Acetylo-CoA na chloramfenikol inaktywując go. Pomiar aktywności: ilość inaktywowanego chloramfenikolu w czasie. Zalety: wysoka stabilność enzymu, wysoka czułość metody, brak konkurencji ze strony enzymów endogennych.

  • Fosfotransferaza II neomycyny (NPT II)

Aktywność kodowanego enzymu w tkankach może być oznaczona metodą enzymatyczną w której kanamycyna i ATP (ze znakowanym radioaktywnie fosforem) są używane jako substraty. Fosforylowane aminoglikozydy są wykrywane przy pomocy chromatografii cienkowarstwowej.


Niektóre zastosowania genów re porterowych:

  • ustalanie regionów promotorów odpowiedzialnych za regulację genów – tworzenie fuzji fragmentów potencjalnego promotora z genem reporterowym → transfekcja komórek → szacowanie aktywności promotora na podstawie oznaczania aktywności białka kodowanego przez gen reporterowy. W analogiczny sposób można przeprowadzić analizę czasowej i/lub przestrzennej aktywności badanych promotorów w komórkach i tkankach.

  • ustalanie wewnątrzkomórkowej lokalizacji białek – tworzenie fuzji cDNA kodującego badane białko z genem reporterowym (najczęściej białkiem zielonej fluorescencji (ang. GFP) lub jego wariantem) i analiza mikroskopowa;

  • wykorzystanie genu lacZ jako reportera w drożdżowym systemie dwuhybrydowym – w tym systemie wykrywa się interakcję między makrocząsteczkami poprzez ekspresję dwóch potencjalnie oddziaływujących cząsteczek w tej samej komórce drożdżowej i aktywację przez powstały kompleks białkowy ekspresji genu reporterowego (do jednego
    z białek dołączona jest domena wiążąca się do DNA, drugie białko jest syntetyzowane w fuzji z domeną aktywującą transkrypcję). Obecność białka reporterowego β-gal wykrywa się poprzez niebieskie zabarwienie komórek drożdży
    w obecności X-gal.


20. MUTAGENEZA W INŻYNIERII GENETYCZNEJ


Wprowadzenie dziedzicznych zmian do materiału genetycznego różnych organizmów. Zmiany genotypu często prowadzą do zmian fenotypu. Mutacje powstają In vivo spontanicznie lub w wyniku indukcji mutagenami. Mutacje mogą być również indukowane In vitro na cele inżynierii genetycznej.

Mutageneza jest niezbędna do ewolucji i dla uzyskania nowych odmian.


HISTORIA:

500 lat p.n.e. Hipokrates opisywał nowotwory. Pierwsze znane mutageny to kancerogeny.

1775 r. Anglia, der Percivall Pott – nowotwory u kominiarzy; 150 lat później wykryto w sadzy czynniki rakotwórcze.

Lata 1890 – Francja, u zbieraczy winogron w Bordeaux wykazano b.dużą zapadalność na nowotwory skóry zw.
z ekspozycją na słońce.

1889 r. Hugo de Vries, fundamentalny proces genetyczny, w Intracellular Pangenesis postuluje dziedziczenie cech przez cząsteczki zwane pangenami I powstawanie gatunku w jednym etapie.

1927 r. Hermann Muller – mutacje Drosophila i człowieka przez promieniowanie X. Ilościowe połączenie promieniowania i śmiertelnych mutacji. Publikacja „The problem of Genetic Modification” – fifth International Congress of Genetics w Berlinie.

1941 r. Charlotte Auerbach – mutacje Drosophila przez czynnik chemiczny – gaz musztardowy.

1944 r. Oswald Avery, McLeod, McCarty – funkcje kwasów nukleinowych. Wyjaśnienie doświadczenia Griffith’sa (podanie myszom wirulentnych bakterii – przeżywają). DNA nie białko to MATERIAŁ DZIEDZICZNY.

Watson , struktura kwasów nukleinowych.

Badanie mikroorganizmów, głównie bakteriofagów.

Badanie E.Coli, synteza naprawcza.


Mutacja to trwała zmiana w sekwencji DNA, która jest przekazywana komórkom potomnym

- reakcja pomiędzy mutagenem a DNA

- wbudowanie analogu nt w procesie replikacji

- błędy replikacji, rekombinacji i naprawie

- pośrednio błędy w transkrypcji i translacji


RODZAJE MUTACJI:

- genomowe

- chromosomowe

- genów

- permutacje – zmiany w sekwencji DNA, które mogą być usunięte w procesie replikacji


MUTACJE GENOMOWE: dotyczące zmiany liczby chromosomów w genomie

  • euploidalność - liczba chromosomów jest zwielokrotniona całkowicie, o całe "n":

- autopoliploidy - organizmy takie powstają, kiedy chromosomy z różnych przyczyn nie rozchodzą się podczas podziału mitotycznego lub mejotycznego, lub kiedy liczba chromosomów się podwaja, a podział jądra nie zachodzi (tzw. endomitoza).

- allopoliploidy - są to osobniki powstałe w wyniku połączenia genomów różnych gatunków, jeśli połączą się gamety o diploidalnej liczbie chromosomów (2n)

  • poliploidalność

  • aneuploidalność - dotyczy tylko pojedynczych chromosomów, może występować w autosomach oraz chromosomach płci:

Trisomia (2n+1):

21 chromosomu – Zespół Downa

13 chromosomu – Zespół Patau

18 chromosomu – Zespół Edwardsa

Chromosomu X – Zespół Nadkobiety

XXY – Zespół Klinefeltera

Monosomia X0 – Zespół Turnera


MUTACJE CHROMOSOMOWE: dotyczą zmiany struktury chromosomów lub ich liczby

  1. Rearanżacje: polegają na zmianie struktury w obrębie jednego chromosomu lub pomiędzy chromosomami niehomologicznymi

  • Delecje (deficiencje) - utrata fragmentu chromosomu

  • Duplikacje (podwojenie odcinka chromosomu, gdy dołączony zostaje dodatkowy odcinek chromosomu homologicznego)

  • Insercje

  • Inwersje (chromosom pęka w dwóch miejscach, a wyodrębniony odcinek zostaje włączony ponownie, lecz po odwróceniu o 1800)

  • Translokacje (przemieszczenie się fragmentu chromosomu w inne miejsce):

  • Translokacje wzajemne – polega na wymianie fragmentów między chromosomami niehomologicznymi, może być przyczyną tworzenia nieprawidłowych gamet, może powodować białaczki

  • Translokacja robertsonowska – powstaje w wyniku połączenia ramion długich dwóch chromosomów akrocentrycznych

  • Chromosom pierścieniowy (kolisty) powstaje w wyniku połączenia się nowych zakończeń, po uprzedniej delecji obu końców chromosomu.

wywoływane mutagenami chemicznymi np. NMU lub promieniowanie UV i X

Izochromosom składa się z połączonych ramion krótkich lub długich.

Mutacje chromosomowe dzieli się na:

  • Zrównoważone – gdy w wyniku zmiany struktury chromosomu nie zmieniła się ilość informacji genet.

  • Niezrównoważone – gdzy ilość informacji genetycznej uległa zwiększeniu lub zmniejszeniu.


MUTACJE GENOWE (PUNKTOWE): zachodzą na odcinku DNA krótszym niż jeden gen; polegają na zmianie właściwej sekwencji nukleotydów (zamianie, wycięciu lub wstawieniu par pojedynczych nukleotydów lub odcinków trochę dłuższych)

  • Delecje(usunięcie jednej lub większej liczby par zasad) : mikrodelecje, makrodelecje

  • Mutacje punktowe(zmiana pojedynczego aminokwasu w sekwencji białka, brak zmian sekwencji aminokwasowej białka, przedwczesna terminacja translacji):

- substytucje(zmiana jednej pary zasad na inną) i tranzycje(zmiana jednej puryny na inną purynę lub zmiana jednej pirymidyny na inną pirymidynę): AT-GC, CG-AT

- transwersja (pirymidyny na purynę lub puryny na pirymidynę): AT-TA, AT-CG, TA-GC, CG-GC

  • Zmiana ramki odczytu: wywołana niskimi dawkami mutagenów lub błędami replikacji (delecje lub insercje)

  • Insercja (wstawienie jednej lub większej liczby par zasad)

Mutacje:

- zmiany sensu

- nonsensowna

- cicha

- zmiana ramki odczytu


Częstość mutacji:

- mutacje/ locus/ generacja

- regiony mutacyjne

- HOT SPOTS (miejsca gorące) - dublety CG nazywamy miejscami gorącymi „hot spot” dla mutacji w ludzkim genomie. Najczęściej metylowaną zasadą jest 5-metylocytozyna, która często występuje w wyspach 5' – CG-3'. Spontanicznie zachodząca deaminacja doprowadza do utworzenia tyminy, co doprowadzi do tranzycji C-T . Ponad 30% wszystkich substytucji nukleotydowych jest spowodowanych deaminacją metylowanej cytozyny.

- w cistronach rIIA i rIIB bakteriofaga T4 (1609 mutacji w 250 miejscach, 815 w dwóch miejscach (rA-517, r131- 289)

- wynikające z sekwencji lub modyfikacji zasad


Częstość mutagenezy spontanicznej

bakteriofag T4 – 10-7

Escherichia coli – 10-9

Drosophila melanogaster – 10-10

Deaminacja cytozyny – powoduje powstanie uracylu, nie zwiększa poziomu mutacji spontanicznych

Metylacja cytozyny – powoduje powstanie 5-metylocytozyny, nie zwiększa poziomu mutacji spontanicznych

Deaminacja 5-metylocytozyny – powoduje powstanie tyminy i po replikacji mutację GC → AT



Istotnym powodem mutacji powodującym choroby genetyczne jest rekombinacja pomiędzy fragmentami podobnymi bądź identycznymi. Wiele genów należy do rodzin genów. Jeżeli takie geny są położone obok siebie na chromosomie może zdarzyć się zarówno w czasie mejozy, ( kiedy zbliżają się do siebie chromosomy homologiczne) jak i w czasie mitozy (po replikacji następuje wymiana pomiędzy chromatydami siostrzanymi).



Mutacje mogą zachodzić spontanicznie oraz pod wpływem różnych czynników zewnętrznych
= MUTAGENÓW:

  1. Czynniki fizyczne:

  • promieniowanie (ultrafiolet, jonizujące)

  • wysoka temperatura

  1. Czynniki chemiczne:

- kwas azotowy (III) - HNO2 - powoduje usunięcie grup aminowych z zasad azotowych, co powoduje np. zamianę cytozyny w uracyl

- związki alkilujące (np. iperyt i jego pochodne) - powodują dołączanie do zasad azotowych grup alkilowych, co również zmienia ich charakter

- analogi zasad azotowych (np. bromouracyl) - nie są prawidłowo odczytywane podczas transkrypcji

- barwniki akrydynowe (np. oranż akrylowy, akryflawina, proflawina) - powodują wstawianie lub wycinanie sekwencji nukleotydowych

- alkaloidy - np. kolchicyna, blokująca tworzenie wrzeciona podziałowego, co powoduje, że chromosomy nie rozchodzą się podczas podziału

- sole metali ciężkich

  1. Czynniki metaboliczne (np. brak jonów Mg2+ lub Ca2+)

  2. Czynniki biologiczne:

  • wirusy (opryszczki, różyczki)

  • pierwotniaki (Toxoplazma)

Uszkodzenia oksydacyjne powstają w wyniku oddziaływania z Reaktywnymi Formami Tlenu – RFT.


CZYNNIK MUTAGENNY

SPOSÓB DZIAŁANIA

Promieniowanie UV

powstanie dimerów pirymidynowych

Promieniowanie X

pęknięcia jedno- i dwuniciowego DNA

5-bromouracyl

analog tyminy, tworzy pary z adeniną i guaniną

2-aminopuryna

analog adeniny, tworzy pary z tyminą i cytozyną

Hydroksyloamina

hydroksylacja cytozyny, pochodna tworzy pary z adeniną

N-metylo-N’-nitro-N-nitrozoguanidyna

synteza metyloguaniny podczas replikacji, powoduje tranzycje i inne typy mutacji

Metanosulfonian metylowy

Metanosulfonian etylowy

alkilacja puryn i pirymidyn

Oranż akrydyny

interkalacja pomiędzy zasady w DNA, powoduje błędy replikacji i mutacje typu insercja lub delecja

Kwas azotowy (III)

deaminacja adeniny, hipoksantyna tworzy pary z cytozyną

deaminacja guaniny, ksantyna tworzy pary z cytozyną

deaminacja cytozyny, uracyl tworzy pary z adeniną


ZMIANY W DNA:

dimery pirymidynowe: stanowią pary zasad tyminy i cytozyny połączone przez reakcję fotochemiczną. Światło ultrafioletowe indukuje powstawanie wiązania kowalencyjnego pomiędzy podwójnymi wiązaniami C=C.

dimery tyminy: 50% wszystkich zmian, wiązanie kowalencyjne łączy at. C sąsiednich Tymin. Naprawa następuje przez wycięcie nt.

usieciowanie komplementarnych łańcuchów DNA

interkalacja mutagenów (bromek etydyny)

pęknięcie jednej nici DNA

pęknięcie dwóch nici DNA (pęknięcie w tym samym ramieniu/w różnych ramionach)

powstawanie ad duktów w DNA (działanie benzopirenu, głównego mutagenu dymu papierosowego), niektórzy ludzie posiadają enzymy, które usuwają addukty.


Mutacje spontaniczne:

- błędy polimerazy - każda zasada DNA może istnieć w formie tautomerycznej wynikającej ze zmiany położenia atomu wodoru związanego z atomem azotu w cząsteczce zasady. Formy tautomeryczne zasad posiadają odmienne właściwości łączenia się w pary przy pomocy wiązań wodorowych. Forma tautomeryczna jest niestabilna i w czasie kolejnej replikacji DNA istnieje prawdopodobieństwo, że adenina powróci do swojego stanu podstawowego
i wytworzy wiązanie komplementarne z tyminą. Cytozyna wbudowana uprzednio do komplementarnej nici DNA połączy się z guaniną.

- deaminacja - proces ten zachodzi z szybkością: 300 deaminacji 5-metylocytozyny 135 deaminacji cytozyny 12 deaminacji adeniny w ciągu doby w komórce człowieka. Utrata grupy aminowej w jednoniciowym DNA przebiega ok. 140 razy szybciej niż w DNA dwuniciowym, dlatego zachodzi ona szczególnie szybko w rejonach aktywnie transkrybowanych oraz w widełkach replikacyjnych.

- utrata puryn i pirymidyn - w warunkach naturalnych traconych jest ok. 10 000 puryn, 100 pirymidyn w przeliczeniu na genom na człowieka na 1 dzień. Miejsca w łańcuchu polinukleotydowym, w którym doszło do utraty puryny pirymidyny określa się jako AP-miejsca apurynowe, apirymidynowe.

Efekty utraty zasady azotowej:

Powstanie pęknięcia łańcucha

Preferencyjne włączanie adeniny do nici syntezowanej podczas replikacji na uszkodzonej matrycy naprzeciw miejsca AP.


U E.Coli jedna substytucja na 108-109 nt. W doświadczeniach replikacyjnych jedna substytucja na 104-105 nt. Korekcja kompleksem polimerazy/ egzonukleazy. Transwersje częstsze niż transpozycje (96% i 4%). Wolne rodniki.

104 premutacji/ dzień u człowieka wywoływanych jest depurynacją, depirymidacją, deaminacją i alkalizacją.


Modyfikacja chemiczna prowadzi do występowania mutacji. Deaminacja cytozyny prowadzi do powstawania uracylu. Bez naprawy podczas replikacji dochodzi do wbudowania komplementarnej adeniny, co związane jest
z występowaniem tranzycji C >T. Naprawa może wystąpić dzięki wycięciu zasad.
Adenina i guanina ulega przekształceniu odpowiednio w hipoksantynę i ksantynę. W wyniku depurynacji dochodzi do delecji jednego nukleotydu, dla którego została usunięta zasada.


Przemysłowe zastosowanie mutagenezy:

- nie stosowane w przemyśle spożywczym

- produkcja enzymów, aminokwasów, antybiotyków

- mutacja/ rekombinacja/ selekcja

- 100 krotny wzrost produkcji


21. ZASTOSOWANIE MUTAGENEZY


Mutageneza- wprowadzenie dziedzicznych zmian do materiału genetycznego różnych organizmów. Zmiany genotypu często prowadzą do zmian fenotypu. Mutacje powstają in vivo spontanicznie lub w wyniku indukcji mutagenami. Mutacje mogą być również indukowane In vitro na cele inż. Genetycznej.

Mutageneza jest niezbędna do ewolucji wszystkich nowych gatunków

Mutacje:

- genomowe

- chromosomowe

- genowe

- permutacyjne

Mutacje powstają przez:

- reakcja między mutagenem a DNA

- wbudowanie analogu nukleotydowego w procesie replikacji

- błędy w replikacji, rekombinacji i naprawie

- pośrednio, błędy w transkrypcji i translacji

Doświadczenie Griffiths’a


Rozmiar: 25962 bajtów

Griffith pracował nad opracowaniem szczepionki przeciwko zapaleniu płuc, wywoływane jest przez bakterie Streptococcus pneumonea. Wówczas nie znano jeszcze antybiotyków, a choroba ta była śmiertelna. Badania przeprowadzane były na dwóch szczepach bakterii, z których tylko jeden wywoływał chorobę, a drugi był niegroźny. Nie wiadomo było, co jest przyczyną zjadliwości, więc Griffith założył, że zależy to od wytwarzania lub braku otoczki. Jak się okazało później założenie było poprawne. Zatem mógł przystąpić do eksperymentu. Jego pierwszą częścią było wstrzyknięcie myszom bakterii szczepu zjadliwego (S), który wytwarzał otoczkę. Jak się okazało wszystkie myszy w niedługim czasie zdechły. Kolejnym etapem było zabicie wysoką temperaturą bakterii zjadliwych (S-) i ponowne wstrzyknięcie ich myszom. Jak można było przewidzieć, żadna nie zachorowała, wszystkie przeżyły. Następnym krokiem było wstrzyknięcie myszom żywych bakterii z niegroźnego szczepu, który nie wytwarza otoczek (R). Tu również jak się spodziewano myszy przetrwały, bez większych uszczerbków na zdrowiu, nie chorując na zapalenie płuc. Najciekawszym punktem eksperymentu był etap, w którym podano myszom jednocześnie martwe bakterie ze szczepu zjadliwego (S-) i bakterie ze szczepu nie wytwarzającego otoczki (R). Jak się okazało wszystkie myszy zachorowały i większość z nich zdechła. Po dokładnej analizie, w ciałach zdechłych myszy z ostatniej fazy eksperymenty znaleziono żywe bakterie pochodzące ze szczepu wytwarzającego otoczkę (S), natomiast nie wykazano obecności bakterii nie wytwarzających otoczki (R). Był to dość niespodziewany wynik doświadczenia. Rozważano zatem kilka rozwiązań zaistniałej sytuacji. Jedną z możliwości było nagłe ożycie bakterii termicznie zabitych, co teoretycznie mogło mieć miejsce, ale wykluczono tę możliwość. Drugą możliwością, którą wkrótce przyjęto za dobry trop było nabranie zjadliwości przez bakterie R, które w jakiś sposób przyswoiły otoczkę od bakterii S. Wytwarzanie otoczki następnie zostało przekazane kolejnym pokoleniom bakterii, a zatem zmiana ta utrwaliła się. W tym momencie pojawiło się wiele kolejnych pytań, w jaki sposób bakterie R nabrały zjadliwości?

Gryffith założył, że bakterie szczepu R nie posiadały w swoim materiale genetycznym genu, który odpowiadał za wytwarzanie otoczki, a w wyniku kontaktu tego szczepu ze szczepem zjadliwym w jakiś sposób pobrały one prawdopodobnie czynnik, który odpowiedzialny jest za jej wytwarzanie, a jednocześnie za zjadliwość. W związku z tym, że ów czynnik przekazany był bakteriom żywym od bakterii martwych musi proces ten zachodzić nie na drodze biologicznej, a chemicznej. Takie przekazanie genu pomiędzy bakteriami nazwano transformacją.

Dopiero w 1953 roku O. T. Afery wraz z współpracownikami wykazał, że to właśnie DNA jest tym czynnikiem, który jest przekazywany w procesie transformacji.

rough strain mysz przeżywa

smooth strain mysz ginie

heat-killed smooth strain mysz przeżywa

rough strain& heat killed smooth strain mysz ginie

Częstość mutacji: (jeśli chodzi o procenty występowania poszczególnych typów mutacji podane są niżej w konkretnych przykładach)

- mutacje/locus/generacja

- regiony mutacyjne

- hot spots (m-ca gorące)

- w cistronach rIIA i rIIB bakteriofaga T4 1609 mutacji w 250 m-cach (rA- 517) (r131-289)

- wynikające z sekwencji lub modyfikacji zasad

Patogenne mutacje punktowe genu CYP21 powstające przez kopiowanie sekwencji pseudogenu. Mechanizm podobny do konwersji genu.

Zmiany w DNA:

  • Dimery pirymidynowe

Stanowią pary zasad T i C połączone przez reakcję fotochemiczną.

Światło UV indukuje powstawanie wiązań kowalencyjnych pomiędzy podwójnym wiązaniem C=C

Dimery tymidyny- najczęściej występują; 50% wszystkich zmian, wiązanie kowalencyjne łączy atomy węgla sąsiednich tymin, naprawa następuje przez wycięcie nukleotydów

  • Usieciowienie komplementarnych łańcuchów DNA

  • Interkalacja mutagenów (bromek etydyny)

  • Pęknięcia jednej nici DNA

  • Pęknięcia dwóch nici DNA, może powstać chromosom kulisty

  • Powstanie adduktów w DNA- działanie benzopirenu- głównego mutagenu dymu papierosowego

Przemysłowe zastosowanie mutagenezy

  • Nie stosowana w przemyśle spożywczym

  • Produkcja enzymów, aa, antybiotyków

  • Mutacja/ rekombinacja/ selekcja

  • 100-krotny wzrost produkcji

Mutageneza

5 bromodeoksyurydyna (Brd Urd

Analog nukleotydów. Może być wykorzystywany do selekcji komórek pozbawionych kinazy tymidyny. Kinaza tymidyny przekształca Brd Urd w toksyczny produkt.

Zmiany w DNA:

- usieciowienie komplementarnych łańcuchów DNA

- interkalacja mutagenów - bromek etydyny

- przesunięcie ramki odczytu

- pęknięcia jednej nici DNA

dwu nici DNA

- powstają w wyniku

- wewnątrzniciowych i międzyniciowych krzyżowań nici

- działania leków przeciwnowotworowych

- rekombinacji mejotycznych

- działania promieniowania X, jonizującego

- działania wolnych rodników i chemikalii

- replikacji pojedynczych pęknięć (single stand break, SSB)

- powstawanie adduktów w DNA- działanie benzopirenu- głównego mutagenu dymu papierosowego

Mutacje spontaniczne

U E coli jedna substytucja na 108-109 nukleotydów

W doświadczalnej replikacji jedna substytucja na 104-105 nukleotydów

Korekcja kompleksem polimerazy egzonukleotydowej. Transwersje częstsze niż tranzycie (96% i 4%)

Wolne rodniki

104 permutacji/dzień u człowieka wywołane depurynacją, depirymidynacją, deaminacją, alkilacją

A

C

G

T

Modyfikacja chemiczna prowadzi do wystąpienia mutacji, deaminacja C prowadzi do powstania uracylu. Bez naprawy podczas replikacji dochodzi do wbudowania komplementarnych A, co związanie jest z wystąpieniem tradycji C do T. Naprawa może występować dzięki wycięciu zasad.

W wyniku depurynacji dochodzi do delecji 1 nukleotydu, dla którego została usunięta zasada.

Synteza naprawcza u wszystkich organizmów- etapy

  • Rozpoznanie uszkodzonego DNA

etap ograniczający

  • Wyodrębnienie uszkodzeń z podwójnej helisy DNA

Przeskakiwanie DNA

Zginanie/ zapętlanie DNA

Rozwijanie helisy DNA

  • Usunięcie uszkodzeń

  • Ligacja DNA

  • Naprawa rekombinantów (recombinational repair RR)

    • Mechanicznie konserwatywny od drożdży do człowieka

    • Bierze udział w naprawie dwuniciowych pęknięć DNA

    • Dwa mechanizmy

Białka zaangażowane w naprawę: HR-RRA, hRAD50, XRCC2/3, BRCA1/2, MRE11, NBS1, XRCC4, ligaza 4DNA, NHEJ-KU70/80, DNAPKcs

      • Rekombinacja homologiczna HR

        • Białko rekom. A (RPA) i inne białka naprawy tworzą włókno

        • Białka (kohezyny) pozycjonują siostrzaną chromatydę.

        • Rad 51 ułatwia wymianę jednoniciowej sekwencji z homologicznym partnerem

        • Zachodzi nachodzenie nici, powstają połączenia Holiaiya i podczas syntezy DNA powstają sekwencje komplementarne

        • Ligazy DNA i resolwazy kończą proces

Powstają 2 kompletne, nieuszkodzone dupleksy DNA

Naprawa bezbłędna

  • Niehomologiczne łączenie końców NHEJ

    • Naprawa dwuniciowych pęknięć przez łączenie niehomologicznych końców DNA

    • Zachodzi gdy hrak homologicznych nici DNA

    • Kompleks białek KU70-KU80 wiąże się do końców pęknięć

    • Włącza się DNA-PKcs prawdopodobnie do parowania końców

    • XRCC4 i ligaza DNA 4 ligują z DNA

    • Powstaje nienaruszony dupleks DNA, ale może dojść utraty lub dodania kilku nukleotydów

  • Naprawa niesparowań (mismatch repair MMR)

Niesparowania to pary zasad różniące się od par Watsona- Cricka

  • Błędy replikacji

  • Deaminacja 5 metylocytozyny- powstaje tymina

  • Rekombinacja między niciami DNA, które nie SA w pełni homologiczne

Naprawa niesparowań występuje u wszystkich organizmów- naprawia błędy poreplikacyjne niesparowania zasada- zasada i niesparowania insercyjnego i delecyjnego

  • Naprawa przez wycięcie zasady (base excision repair BER)

8- oksoguanina jest utleniana formą guaniny. W DNA 8 oksoguanina paruje się z adeniną, co prowadzi do powstania mutacji. 8-oksyguanina usuwana jest u E coli przez produkty genów mutM i MutY. MutM usuwa 8-oksoguaninę (i inne utlenione zasady) a białko MutY adeninę wiąże z 8 oksoguaniną.

  • Naprawa przez wycięcie nukleotydów (nucleotide excision repair NER)

Dimer tymidyny został rozpoznany jako wypętlenie DNA. Nukleaza z kompleksu multiezymu rozluźnia nić DNA po obydwu stronach miejsca mutacji w pewniej od niego odległości, helikaza usuwa wycięty fragment i powstaje duża przerwa obejmująca 20 lub więcej nukleotydów. Do wypełnienia ubytku dochodzi dzieki działaniu polimerazy DNA która kolejno wbudowuje dNMP. Na końcu ligaza DNA łączy odcinki DNA

Błąd replikacji- gdy niesparowany nukleotyd nie zostaje usunięty przez egzonukleolityczne działanie sprawdzające wierność replikacji. U E coli działają produkty genów MutH, MutL, MutS oraz helikaza DNAII i białka SSB wiążące się z pojedynczą nicią DNA. Rozpoznanie nieprawidłowości jest możliwe dzięki początkowemu braku metyzacji nicin potomnej. U człowieka działają homologo MutS (hMSH), homologi Mut Iczłowika (HMLH), działają jako hetero dimery (hMutS/L)

Krótkie tandemowe powtórzenia są podatne na insercje i delecje

Nieprawidłowe parowanie wzajemne przesuniętych nici DNA (w miejscach tandemowych powtórzeń) może prowadzić do wystąpienia insercji lub delecji nici DNA zsyntetyzowanej lub wyjściowej. Działanie enzymów naprawczych usuwających nieprawidłowości sparowania może prowadzić so wystąpienia delecji lub insercji.

Mutacje mogą prowadzić do aktywacji ukrytego miejsca składania i powstawania zmiennego DNA.

Indukowana mutageneza

Mutageneza fizyczna

  • Ogrzewanie

Głównie działa na pary GC powodując tranzycję GC-AT

U faga T$ częstość mutacji 4*10-8 /GC/dzień

  • Zamrażanie i rozmnażanie

Powoduje pęknięcie jedno i dwu niciowe

  • Promieniowanie dalekiego UV

200-300 nm, optymalne 254 nm

Powstają dimery TT, CT, CC w stosunku 2:1:1

Powstają substytucje (60-75%) deficjencje, duplikacje

  • Promieniowanie bliskiego UV

320-400nm Efekt letalny i mutagenny, mniejszy niż w przypadku promieniowania dalekiego, wzrasta w obecności światłoczułych czynników. Występują substytucje i przesunięci ramki odczytu

  • Promieniowanie jonizujące

Obejmuje promieniowanie X, β, γ. Powstające efekty mutagenne to tranzycie, trans wersje i przesunięcia ramki odczytu.

Powstają pęknięcia jedno i dwu niciowe w większości podlegające naprawie

Mutageneza chemiczna

  • Mutageny działające na nierepl. DNA

    • Kwas azotowy

Powoduje deaminację A, C i G odpowiednio na hipoksantynę, uracyl i ksantynę. Ponadto indukuje krzyżowe wiązanie pomiędzy komplementarnymi niciami powodując deficjencję

    • Hydroksylamina

Reaguje z pirymidynami. Mutagenna jest tylko reakcja z C, wywołująca tautomeryzację i parowanie z A czego efektem są tranzycie GC-AT

    • Czynniki alkilujące

Obejmuje różne chemicznie czynniki działające jako mutageny, kancerogeny i antykancerogeny. Wspólna ich cechą jest zdolność przenoszenia alkalicznych grup. Większość działa jako monofunkcyjne czynniki, przenosząc jedną grupę, dwu i wielo funkcyjne indukują wewnętrzne i zewnętrzne wiązanie krzyżowe w DNA

  • Mutageny działające na repl. DNA

    • Analogi zasad

Są słabymi mutagenami, które ze względu na strukturalne podobieństwa inkorporowane są do replikowanego DNA w miejsce prawidłowych zasad. Powodują tautomeryzację i tranzycję AT-GC lub GC-AT w zależności od formy uzytego analogu

  • Mutacje ramki odczytu

Mutageny interkalujące w cząsteczce DNA powodują addycję lub delecję kilku nukleotydów, przez co zmieniają ramkę odczytu. Najważniejsze to akrydyny, indukują w ciemności głównie przesunięcia ramki odczytu, w świetle widzialnym tranzycję i transwersję

  • Mutageny interkalujące w cząsteczce DNA powodujące addycję lub delecję kilku nukleotydów

Mutageneza ukierunkowana

  • Zmiany w strukturze białka, poprzez ściśle określone zmiany w sekwencji nukleotydowej genów kodujących badane białko

  • Zastosowanie: sposób określania funkcji różnych części białek a także są istotne dla rozwoju nowych enzymów do celów biotechnologicznych

  • Aby wprowadzić mutację do sklonowanego genu, można wykorzystać prawie nieograniczoną różnorodność manipulacji DNA w miejscu restrykcyjnym i usunięcia kilku nukleotydów albo wstawienie nowego DNA w miejsce restrykcyjne. Są to zmiany na względnie dużą skalę. Aby zmienić pojedynczy nukleotyd w konkretnej pozycji, używa się techniki nazwanej mutagenezą ukierunkowaną przez ologonukleotyd. Wpierw przez klonowanie w wektorze M13 otrzymuje się jednoniciowe wersje genu. Sterylizuje się krótki ologonukleotyd komplementarny do odpowiedniego obszaru genu, ale zawierający jednonulkeotydową zmianę. Oligonukleotyd hybrydyzuje z DNA i stanowi starter do syntezy nici, reakcje przebiega wokół kolistej cząsteczki matrycy, jak pokazano wyżej.

  • Po wprowadzeniu do E. coli replikacja DNA dostarcza licznych kopii takiej zrekombinowanej cząsteczki DNA dostarcza licznych kopii takiej zrekombinowanej cząsteczki DNA. Połowa uzyskanych dwuniciowych cząsteczek to kopie oryginalnej nici DNA, a połowa- nici zawierającej zmutowaną sekwencję. Dwuniciowe cząsteczki DNA kieruja syntezą cząstek faga, więc około połowy z uwolnionych fagów z zainfekowanej komórki niesie jednoniciową formę zmutowanej cząsteczki> Fagi wysiewa się na stały agar, by utworzyły łysinki, i te, które są zmutowane, identyfikuje się przez hybrydyzację z oryginalnym nukleotydem. Zmutowany gen można ponownie umieścić w oryginalnym gospodarzu wykorzystując rekombinację homologiczną lub przenieść do wektora E. coli zaprojektowanego do syntezy białek ze sklonowanego DNA, aby otrzymać próbkę zmutowanego białka i ustalić efekt mutacji.



Przykłady ochrony przed działaniem mutagennym- FOTOREAKTYWACJA

Fotoreaktywacja - jeden z mechanizmów naprawy DNA, w którym enzym fotoliaza specyficznie reaguje z jedno- lub dwuniciowym fragmentem DNA, zawierającym fotodimery pirymidyn. Pod wpływem światła o długości fali 310-480 nm, następuje enzymatyczne rozszczepienie fotodimerów do monomerów i przywrócenie DNA do stanu pierwotnego. Zachodzi bezustannie w organizmie, w komórkach narażonych na działanie promieni UV.

Enzym fotoliaza odpowiedzialny za fotoreaktywację został wykryty u bakterii (m.in. Eschericha coli), grzybów, roślin i niektórych kręgowców.

22. ROŚLINY TRANSGENICZNE


Rośliny transgeniczne – do dowolnej rośliny możemy wprowadzić wybrany gen, a tym samym otrzymać roślinę transgeniczną o zmienionym zasobie informacji genetycznej

Nie wszystkie rośliny nadają się do transformacji, najlepiej jest wykorzystywać do modyfikacji rośliny o małej zawartości DNA oraz prostym i dobrze poznanym sposobie rozwoju.

Inżynierię genetyczną do otrzymywania transgeniczncyh roślin stosuje się gdy:

- cecha nie występuje w roślinie

- interesujące właściwości nie mogą być ulepszone metodami konwencjonalnymi

- konieczny jest długi czas do wprowadzenia i/lub poprawienia cechy metodami konwencjonalnymi

Nowoczesne metody uprawy są wielodyscyplinarne, wykorzystywana jest bioinformatyka, genetyka molekularna i inżynieria genetyczna.


Cele transgenezy roślin :

- ocena mutacji wprowadzonych do genów

- uzyskiwanie (izolacja) genów odpowiedzialnych za syntezę określonych białek

- analiza konsekwencji fizjologicznych lub ekspresji specyficznych białek

- produkcja dużych ilości białek, które normalnie uzyskiwane są w ograniczonych ilościach

- potwierdzenie, że wyizolowane geny kierują syntezą określonych białek lub są odpowiedzialne za czynności fizjologiczne

Cele modyfikacji roślin uprawnych:

- odporność na herbicydy (tytoń, soja, rzepak, pomidor, kukurydza)

- odporność na działanie niekorzystnych warunków np. mróz , suszę, zasolenie gleby ( ziemniak odporny na mróz z genem flądry arktycznej )

- odporność na choroby wirusowe, bakteryjne, grzybice ( tytoń odporny na wirusa mozaiki tytoniu)

- odporność na szkodniki żerujące na liściach ( rośliny produkują pestycydy zabijające owady)

- przedłużenie okresu przydatności do spożycia i ułatwienie zbiorów

Etapy transgenezy roślin :

- izolacja i klonowanie genu

- przygotowanie konstrukcji genowej

- opracowanie metod wprowadzenia transgenu do rośliny

- selekcja transformatorów

- hodowla in-vitro

- hodowla w glebie

- ocena stabilności transgenu

Metody wprowadzania DNA do komórek roślinnych:

- infekcje Agrobacterium tumefaciens

- infekcje wirusowe

- biblistyka

- metody fizyko – chemiczne ( destabilizacja błon, elektroporacja, sonikacja, lasery mikrowiązkowe, włókna silikonowe )

System Agrobacterium

Niektóre bakterie glebowe z rodziny Rhizobiaceae wnikające do tkanek roślin dwuliściennych indukują powstawanie narośli tumorowych.

Naturalne właściwości dwóch gatunków Agrobacterium znalazły praktyczne zastosowanie w inżynierii genetycznej :

- Agrobacterium tunefaciens prowadzą do pojawienia się narośli rakowych na szyi korzeniowej

- Agrobacterium rhizogenen wywołują powstanie obfitej masy korzeni włosowatych

Wirulentne właściwości A-tunafaciens warunkuje plazmid Ti :

- kolisty, pozachromosomowy DNA

- 25 genów, 7 jednostek transkrypcji

- w czasie infekcji T-DNA przenoszony do komórki roślinnej

- białka CON i VIR uczestniczą w przenoszeniu T-DNA

Selekcja i ocena efektywności transformacji:

- geny selekcyjne, geny oporności na antybiotyki

- geny reporterowe, szybkie potwierdzenie transformacji i jej wydajności metodami biochemicznymi, spektrofotometrycznymi lub fluorometrycznymi : glukuronidaza ( GUS), lucyferaza ( LUC), enzymy biosyntezy antocyjanin, zielone białko fluoryzujące (GFP)


23. WPROWADZENIE GENÓW DO KOMÓREK ROŚLINNYCH


Czynniki destabilizujące błony komórkowe


Najczęściej protoplasty inkubowane są z DNA w obecności PGE, L-ornityny, alkoholu poliwinylowego lub jonów dwuwartościowych. Daje zadowalające efekty dla szeregu grup roślin. Inkubacja trwa zwykle 2-5 lub 20-30 min. Bardzo ważne jest przygotowanie protoplastów, pH, stężenie czynników chemicznych, forma DNA. Ostatnio udane próby z komórkami w miejsce protoplastów. Stosowana jest też precypitacja DNA – CaCl2 fosforanem. Straty pobierane są przez komórki na drodze endocytozy.


Biolistyka

Biologia i balistyka. Wprowadzenie do całych komórek i tkanek makrocząsteczek pokrytych DNA za pomocą mikrowyrzutni. Najczęściej są to metalowe kulki o średnicy 0,2 – 2 μm.

Wyrzut uzyskuje się prochem strzelniczym, wysokim ciśnieniem lub rozładowaniem elektrycznym. Kuleczki wolframu lub złota pokryte są DNA tak, aby DNA zatrzymał się w komórce. Dochodzi do okresowej, przemijającej ekspresji lub trwałego wbudowania w genom. Tą techniką uzyskano transformację roślin odpornych na infekcję Agrobacterium, np. sorgo, owies, pszenica, ryż, soja, kukurydza.

Możliwa jest tez transformacja organelli. Komórki bombardowane w fazie G2 i M dają 4-6 razy wyższą transformację.

Inne metody bezwektorowe

Elektroporacja i elektroforeza

W elektraporacji dochodzi do rozładowania kondensatora perforującego błony komórkowe, 1 ms, 700 V/cm. Perforacja jest przejściowa, lecz wystarczająca do przejścia DNA do komórki.

W elektroforezie (elektrofekcja) DNA migruje w polu elektrycznym, przechodząc do komórki.

Elektroporacja stosowana jest już rutynowo, a elektroforeza jedynie sporadycznie. Elektroporacji można poddać nie tylko protoplasty, ale też całe komórki, skrawki tkanek i pyłek.

Włókna silikonowe

Miesza się intensywnie z komórkami i DNA. Dochodzi do wielokrotnych uszkodzeń błony komórkowej i wprowadzenia do komórkowego DNA. Mechanizm nie jest w pełni wyjaśniony.

Zalety: prostota i transformacja komórek.

Wady: duża śmiertelność komórek.

Laser mikrowiązkowy

Komórki umieszcza się w pożywce hipertonicznej, a następnie perforuje laserem, co prowadzi do pobrania DNA. DNA ulega przejściowej ekspresji.

Sonikacja

Jest stosunkowo nową techniką. Łagodne działanie ultradźwiękami na protoplast buraka doprowadza do przejściowej ekspresji podanego DNA. Technika prosta i tania.


SELEKCJA I OCENA EFEKTYWNOŚCI TRANSFORMACJI

Konstrukcje do transformacji oprócz przenoszonego genu zawierają też:

geny selekcyjne – geny odporności na antybiotyki

geny reporterowe – szybkie potwierdzenie transformacji i jej wydajności metodami histochemicznymi, spektrofotometrycznymi lub fluorometrycznymi: glukuronidaza (GUS), lucyferaza (LUC), enzym biosyntezy antocyjanin, zielone białko fluoryzujące (GFP).



ROŚLINY TRANSGENICZNE


Wykorzystanie roślin GM do praktycznych zastosowań
Człowiek, kiedy jeszcze nie znał metod transformacji genetycznej musiał poprawiać jakość roślin stosując hodowlę kierunkową i krzyżując ze sobą rośliny o najlepszej jakości. Takim zabiegom zostawały poddawane zboża przez blisko 10 000 lat. Dziś kontynuacją dla tych działań jest inżynieria genetyczna, która nie wymaga, aż tak długiego czasu na zaistnienie pożądanej cechy.

Obecnie do modnych w transformacji genetycznej roślin należą takie cechy jak: odporność na grzyby, wirusy, owady, tolerancja herbicydów, biosynteza skrobi. Dodatkowo należy pamiętać, że roślina jest w stanie wyprodukować prawie każde białko, co czyni ją potencjalnym bioreaktorem do produkcji biofarmaceutyków, czy plastików ulegających biodegradacji (geny kodujące enzymy: reduktazę acetylo CoA i syntetazę poli(3-hydroksymaślanu) pochodzące z bakterii).

Rośliny odporne na zasolenie

Odporność na sól jest bardzo ważną cechą. Badania na modelowej roślinie Arabidopis thalianaumożliwienie przeżycia, np. 10-ciodniowego stresu wywołanego suszą (nadmiar soli wywołuje niezdolność korzeni do pobierania wody poprzez stres osmotyczny i zniszczenie enzymatyczne cytoplazmy oraz przez zniszczenie enzymów niezbędnych do syntezy białek i fotosyntezy). Zdolność do fizjologicznych procesów umożliwiających odgradzanie soli jest przenoszona do roślin uprawnych.

Wiele obszarów Ziemi zostało wyłączonych z uprawy ze względu na wysokie zasolenie lub silnie zasadowy odczyn gleby. Gen tolerancji na wysokie zasolenie pochodzący z mangrowców (Avicennia marina) umożliwia stworzenie roślin transgenicznych znoszących duże zasolenie, co daje nadzieję na wykorzystanie części nieużytków.


Odporność roślin GM na szkodniki
Grupy genów odpowiedzialne za kodowanie białek toksycznych dla owadów:

geny Bt kodujące białka Cry:

Bacillus thuringiensis, bakteria występująca w glebie, pozwoliła człowiekowi już od lat 30. XX wieku wykorzystywać białko Cry tej bakterii jako naturalny środek ochrony roślin. Dzięki inżynierii genetycznej można bez problemu umieścić taki gen w genomie rośliny, a jego produkt zwalcza jej szkodniki i jest obojętny dla człowieka i zwierząt.
Aby ten biopestycyd mógł skutecznie działać, w komórkach nabłonka jelitowego owada muszą występować odpowiednie receptory, z którymi białko
Cry połączy się i rozpocznie działanie, tym samym to rozwiązanie ogranicza chemiczną „opiekę” nad uprawą co znacznie redukuje koszty produkcji. Białka Cry ulegają rozkładowi w przewodzie pokarmowym żerujących owadów na aktywne toksyny. Wrażliwe na toksyny są owady z rzędu: Lepidoptera, Coleoptera i Diptera. Żywym przykładem na takie wykorzystanie białka Cry jest:

- kukurydza Bt, która jest odporna na omocnicę prosowiankę(Ostrinia nubialis). Szkodnik ten jest nie tylko utrapieniem na rolników z USA czy z Europy Południowej. Problem dotyczy też Polski, gdzie omacnica pochłonęła 40% upraw (dane z 2006r.) i nadal jest zagrożeniem z powodu ciepłych zim;

- ziemniaki odporne na stonkę;

- bawełna odporna na żerujące gąsienice motyli.
Uprawy roślin opatrzonych symbolem
Bt czeka złoty wiek z powodu braku konieczności stosowania chemicznych środków ochrony roślin, aby powstrzymać szkodniki z rzędu Lepidoptera. To czyni uprawę tańszą, a przede wszystkim zdrowszą.

  • geny inhibitory enzymów trawiennych owada

Gen inhibitora proteazy II wprowadzony do tytoniu zapewnił ochronę przed larwami Manduca sexta (motyl z rodziny zawisaków).


Odporność roślin GM na choroby

Choroby na jakie cierpią rośliny mogą być wywoływane przez wirusy, bakterie i grzyby.


odporność na patogeny grzybowe: transgeny chitynaz i β-1,3-glukanaz, geny odporności (R) współdziałające z genami awirulencji patogena.

- Porażenie zboża powodowane przez grzyba z rodzaju Fusarium nie tylko negatywnie odbija się na kieszeni hodowcy, ale także i na jego zdrowiu. Porażone zboże zawiera mykotoksyny, które prócz zatruć pokarmowych, powodują blokowanie syntezy DNA i zakłócenie metabolizmu RNA, a to już najkrótsza droga do nowotworu. Genetycznie „ulepszone” zboża są wyposażone w enzymy (glukanazy, chitynazy), które rozkładają ściany komórkowe grzyba, powodując tym jego kres.

- geny kodujące chitynazy i glukanazy podniosły odporność roślin pomidora na fuzariozę

- gen kwaśnej glukanazy lucerny z genem chitynazy powoduje odporność roślin transgenicznych tytoniu na Cercospora nicotianae.

- grzyb Sclerotina sclerotiorum wydziela kwas szczawiowy. Wykorzystano gen dla oksydazy kwasu szczawiowego wyizolowanego z cDNA korzenia jęczmienia i wprowadzono do rzepaku, co dało mu odporność na zgniliznę twardzikową wywoływaną przez Sclerotina sclerotiorum.

odporność na choroby wirusowe


Jak uzyskać roślinę odporną na wirusa? W tym celu wprowadza się do komórek rośliny np. geny odpowiedzialne za wytworzenie otoczki białkowej u wirusa. Roślina zawiera wirusowe białka, ale nie choruje, dodatkowo wirus nie infekuje już takiej komórki, gdyż „myśli”, że natrafia już na same zainfekowane.


- Przykładem takiego rozwiązania jest papaja – roślina bogata w witaminę A i C, uprawiana na Hawajach, gdzie przeszło 80% plantacji to uprawy transgeniczne typu UH Rainbow. Powodem stosowania transgenicznych odmian jest wirus pierścieniowatej plamistości papai (PRSV), który podróżuje razem z mszycami.

- Taką odporność na wirusa posiada również dynia, która jest niewrażliwa na wirusa mozaiki wirusa (CMV), wirusa drobnej plamistości cukinii (ZYMV), wirusa mozaiki kawona (WMV), jak również ziemniak odporny na wirusa Y (PVY) i wirusa liściozwoju ziemniaka (PLRV).
- gen białka płaszcza wirusa CP, np. gen TMV - odporność tytoniu na wirusa mozaiki tytoniu

- gen wirusowej replikazy

- gen wirusowej proteazy

Tolerancja roślin GM na herbicydy
Herbicydy są jednymi ze środków jakich używa się w uprawach polowych. Mają one za zadanie niszczenie chwastów. Środki te stosuje się oddzielnie na chwasty jednoliścienne, dwuliścienne i na chwasty szczególnie uciążliwe, które można zaliczyć do obydwu tych klas. Stosowanie herbicydów wymaga od rolnika znajomości tematu, gdyż stosowanie ich w nieodpowiednim czasie mogłyby zniszczyć nie tylko chwasty, ale i rośliny uprawne.

Rośliny genetycznie zmodyfikowane są odporne na działanie herbicydów. Tę cechę gwarantuje im gen, który wytwarza enzym rozkładający aktywne składniki środka chwastobójczego. Z takiego rozwiązania płynie wiele korzyści, do których można zaliczyć m.in.:
* Możliwość wykonania zabiegu w różnych terminach,
* Mniejsza liczba zabiegów, gdyż za jednym razem są niszczone chwasty jedno- i dwuliścienne,
* Ochrona środowiska, poprzez mniejsze zużycie środka aktywnego,
* Redukcja kosztów produkcji, przez zmniejszenie zakupu ilości herbicydów.

- Aby roślina stała się odporna na działanie herbicydu totalnego stosuje się
modyfikację typu Roundup Ready, która jest jedną z najczęściej stosowanych. Aktywnym składnikiem, który niszczy roślinę nietransgeniczną jest glifosat. Glifosat hamuje syntazę EPSPS, enzymu który jest odpowiedzialny za syntezę aminokwasów aromatycznych. Roślina transgeniczna jest wyposażona w gen kodujący syntazę EPSPS oporną na działanie glifosatu (gen bakterii Salmonella typhimurium – aroA), oraz gen kodujący oksydoreduktazę glifosatu – enzym który rozkłada glifosat. Soja, która jest jedną z najczęściej uprawianych roślin z odpornością na działanie herbicydu, powiększyła ofertę koncernów biotechnologicznych, które wyszły naprzeciw rolnikom i oferują herbicydy razem z nasionami roślin odpornymi na ich działanie.


- Inną metodą modyfikacji roślin pod kątem odporności na działanie herbicydów jest
wprowadzenie do rośliny genu PAT (kodującego enzym acetylotransferazę fosfinotrycyny). Gen ten pochodzi z bakterii glebowej Streptomyces hygroscopicus i koduje odporność na glufosynat – aktywny składnik herbicydu Basta. Enzym ten poprzez acetylację inaktuwuje glufosynat. W ten sposób na polu opryskiwanym herbicydem przeżywają tylko rośliny transgeniczne, chwasty - nie zawierające genu PAT, a przez to nie odporne na herbicyd - giną. Modyfikacji genem PAT poddano już m.in. rzepak, soję i buraka cukrowego, a transgeniczne pszenżyto uzyskane w 1995 roku przez prof. Janusza Zimnego z Instytutu Hodowli i Aklimatyzacji Roślin w Radzikowie było pierwszym na świecie odpornym na herbicyd Basta.



Modyfikacje cech użytkowych roślin.

Ingerencja w metabolizm związany z dojrzewaniem

- To, że roślina otrzymuje nowe właściwości jest sprawą dodawania, usuwania lub zmniejszania bądź zwiększania aktywności genów. Tak było w przypadku pomidora FlavrSavr, który w 1994 roku jako pierwsza transgeniczna roślina wprowadzona do powszechnego obrotu miała podbić świat. Cechą charakterystyczną tego pomidora było zmniejszenie aktywności genu poligalakturonazy, odpowiedzialnego za rozkład frakcji pektynowych ściany komórkowej. Sprawiało to, że pomidor wolniej dojrzewał, a tym samym był dłużej świeży, co mogło pomóc w transportowaniu go na duże odległości. Odmiana jaką użyto do uzyskania tego pomidora nie była najlepsza, dlatego po kilku latach zdecydowano o zaprzestaniu jego produkcji.
- goździki transgeniczne o przedłużonym okresie kwitnienia


Zmiany w metabolizmie węglowodanów, tłuszczów, aminokwasów

- bakteryjny gen pirofosforylazy ADP-glukozy (kluczowy gen biosyntezy skrobi) wprowadzony do DNA amyloplastów ziemniaków niskoskrobiowych powoduje podwyższenie zawartości skrobi w bulwach ziemniaka (do 60%).

- wprowadzenie do rzepaku genu desaturazy kwasu stearynowego spowodowało podwyższenie zawartości nasyconego kwasu stearynowego z 2 do 40% a obniżenie nienasyconego kwasu oleinowego

- „Grzebanie” w genach pozwoliło uzyskać roślinę, która posiada zmienioną kompozycję aminokwasów. Przykładem tego jest transgeniczna kukurydza LY038, która posiada zwiększoną ilość lizyny. Aminokwas ten jest konieczny do budowy białek w początkowych fazach rozwoju organizmu, wzmaga procesy zapamiętywania i wspomaga organizm w czasie przeziębienia. Po skrzyżowaniu kukurydzy LY038, z również transgeniczną odmianą MON810, uzyskano roślinę o zwiększonej zawartości lizyny i odporności rośliny na szkodniki typu Bt.


Rośliny transgeniczne mogą też służyć jako bioreaktory do syntezy ważnych białek przemysłowych:

- α-amylaza – do upłynniania skrobi

- β-glukanaza – produkcja piwa

- peroksydaza ligniny – przemysł papierniczy





ZASADA PRODUKCJI (ODKRYCIE, FAZA I,II,III,IV)


  1. Odkrycie (24 – 48 miesięcy): identyfikacja genu (cechy) oraz wysokowydajne przeszukiwanie

  2. Faza I (12 – 24 miesięcy): ocena pomysłu oraz testowanie genu w roślinie

  3. Faza II (12 – 24 miesięcy): wczesny rozwój produktu, próby polowe oraz działania przedregulacyjne

  4. Faza III (12-24 miesięcy): zaawansowany rozwój, pomiar wydajności, dane regulacyjne

  5. Faza IV (12-36 miesięcy): ostateczne regulacje zgłoszeniowe, produkcja nasion


CO NALEŻY PODAĆ PRZY ZGŁASZANIU ROŚLIN TRANSGENICZNYCH


W Polsce kwestie te reguluje ustawa z dnia 11.05.2001 „O warunkach zdrowotnych żywności i żywienia”. W myśl przepisów tej ustawy podmiot ubiegający się o produkcję nowej żywności lub wprowadzenie jej do obrotu jest zobowiązany poddać swój produkt procedurze niezbędnej do stwierdzenia, że nie stanowi on zagrożenia dla zdrowia lub życia człowieka oraz środowiska, niezależnie od procedury przewidzianej w ustawie (z 22.06.2001) „O organizmach genetycznie zmodyfikowanych”.

Podmiot występuje z odpowiednim wnioskiem do Głównego Inspektora Sanitarnego.


Wniosek taki powinien zawierać następujące informacje:

  • charakterystykę nowej żywności,

  • przewidywaną wielkość produkcji lub ilość żywności wprowadzonej do obrotu, jeżeli jest to żywność zawierająca GMO,

  • dane identyfikujące przedsiębiorcę.

Do wniosku należy dołączyć zaświadczenie z Krajowego Rejestru Sądowego oraz dokumentację zawierającą dane dotyczące:

  • składu, wartości odżywczej i przeznaczenia nowej żywności,

  • obecności GMO oraz zastosowanych technik modyfikacji genetycznej,

  • znakowania takiej żywności.

Cała dokumentacja musi być zaopiniowana przez wyznaczonych ekspertów lub wyznaczone jednostki naukowe, właściwe ze względu na przedmiot postępowania, a w uzasadnionych przypadkach do przeprowadzenia badań laboratoryjnych na koszt przedsiębiorcy.

W przypadku stwierdzenia, że „nowa” żywność GM jest bezpieczna Główny Inspektor Sanitarny podejmuje decyzję o produkcji żywności lub wprowadzeniu jej do obrotu.



24. ROŚLINY GMO DOSTĘPNE NA RYNKU


Kukurydza:

  • Jedno z 3 najważniejszych zbóż

  • Wszczepiony gen Bacillus thuringiensis- zabezpiecza przed żerowaniem szkodników

  • Odporność na herbicydy

  • Obniżona zawartość fosforu występujących w nieprzyswajalnej dla zwierząt postaci

  • Wyższa zawartość tłuszczów

  • Wytwarzanie związków chemicznych używanych do wyrobu leków lub szczepionek

  • 24% upraw jest transgenicznych

  • Argentyna, Brazylia , Kanada ,Chile, Czechy Egipt Niemcy Polska

Ziemniaki:

  • Odporność na herbicydy

  • 4 co do wlk źródło żywności

  • Wydzielanie insektycydów (toksyny Bacillus thuringiensis bądź białka wytwarzenie przez przebiśniegi a przerywające cykl rozwojowy owadów)

  • Odporność na choroby (wirusy X, Y, liściozwoju)

  • Podwyższana wartość pokarmowa

  • Odmiany których skrobia składa się wyłącznie z amylopektyn(u tradycyjnych odmian kosztowne usuw.amylozy)

Rzepak:

  • Canola- odmiana rzepaku, o obniżonym poziomie kwasów nasyconych

  • Odporność na herbicydy

  • Zwiększony poziom k. laurynowego

  • Zwiększony poziom k. oleinowego

  • Sterylność męska dla ułatwionej hybrydyzacji

  • 20% upraw jest transgenicznych

  • Kanada, Chile, USA

  • Canola argentyńska, Canola polska

Buraki cukrowe:

  • Pokrywa 1/3 zapotrzebowania na cukier

  • Odporność na herbicydy

  • Odporność na wirusy

  • Synteza fruktanów

  • Odporność na szkodniki

  • Odmiana, którą można dłużej przechowywać bez powodowania strat w zawartości cukru

Cukier, dodatek do pasz, aminokwas glutaminian jednosodowy do poprawiania zapachu i smaku,część zielona do zapylania lub jako dodatek żywnościowy

Pszenica

  • odmiana z wszczepionym genem warunkującym większą niż normalnie zawartość glutenin w ziarnie, co podwyższa jego wartość wypiekową.

Koniczyna

  • odmiana odporna na herbicydy zawierające bromoksynil.

Cykoria

  • odmiana odporna na pestycydy zawierające glufozynat.



Soja:

  • Odporność na herbicydy

  • Odporność na szkodniki

  • Podwyższona wartość pokarmowa

  • Podwyższona zawartość kwasów nienasyconych

  • 70% to soja transgeniczna

  • Produkcja: Argentyna, Boliwia. Brazylia, Kanada, Chile, Meksyk, Paragwaj, RPA, USA.

  • 3000 lat p.n.e w Chinach więcej aa niż mięso, podst.żywność

Pomidory:

  • Opóźnione dojrzewanie

  • Odporność na herbicydy

  • Odmiany z grubszą skórką o zmienionej zawartości pektyn co zwiększa ich przydatność do przetwórstwa

  • Odmiany, u który nie pojawia się enzym powodujący miękniecie owocu

Ogórki

  • odmiana z genem afrykańskiego krzewu półpustynnego, dzięki czemu białko ogórka ma słodki smak.

Truskawki

  • wyższa słodkość owoców,

  • spowolnienie dojrzewania

  • odporność na mróz

  • odmiana z wszczepionym genem grochu krowiego warunkującym produkcję enzymu chroniącego roślinę przed żerowaniem szkodników,

  • odmiana z genem ryżu, dzięki czemu zmieniona jest ich reakcja na światło, co powoduje wytwarzanie większej ilości pędów rozłogowych,

  • odmiana wydzielająca zapach odstraszający owady

Jabłka:

  • Oporność na paracha jabłoni, szarą pleśń, raka gruzełkowatego drzew owocowych

  • Opóźnione dojrzewanie

  • odmiana z genem grochu krowiego warunkującym produkcję enzymu chroniącego roślinę przed żerowaniem szkodników,

Tytoń:

  • Odmiana większa o 20%

  • Odmiana z genem przebiśniegu warunkującym produkcję białka przerywającego cykl rozwojowy szkodników

Bawełna

Podstawowe włókno:

  • Odporność na szkodniki i herbicydy

  • 46% upraw jest transgenicznych

  • Produkcja: Australia, Brazylia, USA Chiny, Kolumbia, Indie, Meksyk, RPA

Ryż:

  • Wprowadzenie genów odpowiedzialnych za biosyntezą prowitaminy A

  • Promotory do ekspresji w endospermie

  • Wzrost poz.łatwo przyswajalnego Fe poprzez uszczepienie ferrytyny

  • Złoty ryż” dostarcza witaminę A przez syntezę i przechowywanie beta karoteny

  • Odporność na herbicydy


Kabaczek:

  • Odporność na wirusy (watermelon mosaic viruss. WMV i Lucchini yellow mosaic virus ZYMV)

  • Najbardziej pożądanie są delikatne kabaczki w lecie

Papaje:

  • Podstawowy składnik żywnościowy w płd.-wsch. Azji

  • Wzrost uprawy i spożycia.

Mango:

  • Jabłko lub brzoskwinia tropików

  • 40% wszystkich owoców tropikalnych

  • Opóźnione dojrzewanie

  • Ulepszenie zapachu

Banany:

  • 4. Miejsce co do wielkości upraw

  • Produkt żywnościowy bez tłuszczu, wysoki poziom potasu i włókna, dobre źródło witaminy C

  • Opóźnione dojrzewanie

  • Źródło jadalnych szczepionek

  • Odporność na wirusy, nicienie, grzyby

Ananasy:

  • Odporność na zarazy i wirusy

  • Opóźnione dojrzewanie

Kokosy:

  • Olej kokosowy- konfekcje, olej jadalny, kosmetyki, detergenty, margaryny, szampony. Mydła

  • Zwiększenie poziomu kwasu laurynowego

Jęczmień:

  • Poprawa jakości ziarna

  • Oporność na zaraz i choroby

Słodkie ziemniaki:

  • Podstawowe źródło pożywienia w Afryce

  • Nie wymaga uprawy

  • Można zbierać od razu

Inne rośliny

  • Sałata
    - produkująca szczepionkę na zapalenie wątroby typu B - można się szczepić jedząc sałatę - została ona opracowana przez naukowców z Instytutu Chemii Bioorganicznej PAN w Poznaniu pod kierownictwem prof. Legockiego.

  • Winogrona
    - odmiany bezpestkowe


Światowy areał transgenicznych upraw

Powierzchnia upraw roślin genetycznie zmodyfikowanych po raz kolejny znacząco wzrosła w 2008 roku, utrzymując stabilną tendencję wzrostową, popartą zwiększoną wolą polityczną szukania rozwiązań gwarantujących zaspokojenie wzrastającego zapotrzebowania na żywność – wynika z raportu opracowanego przez Międzynarodowy Instytut Propagowania Upraw Biotechnologicznych (ISAAA) zatytułowany Globar Status of Commercialized Biotach/GM crops 2008. W roku 2008 wzrosła o 1,3 miliona liczba rolników uprawiających rośliny transgeniczne w swoich gospodarstwach na łącznej powierzchni 10,7 miliona hektarów. Z czego najczęściej uprawiana jest transgeniczna kukurydza i soja.
Po raz pierwszy w ubiegłym roku podjęto uprawę tych roślin w Burkina Faso, Egipcie i Boliwii. Spośród 25 państw, w których obecnie uprawia się rośliny transgeniczne, 15 - to kraje rozwijające się. Największą powierzchnię zajmuje uprawa tych roślin w USA (62,5 mln ha), Argentynie (21,0 mln ha) i Brazylii (15,8 mln ha). W coraz większym stopniu rośnie rola Chin, Indii i Brazylii jako światowych liderów rozwoju uprawy roślin transgenicznych. Stanowi ona szansę na podniesienie dochodów, co w szczególnie ubogich krajach ma duże znaczenie. Badania prowadzone w Indiach, Chinach, Afryce Południowej i na Filipinach wykazały, że przy uprawie roślin transgenicznych dochody uzyskiwane z 1 hektara wzrosły ze 115 do 250 dolarów.

  • USA

  • Argentyna

  • Brazylia

  • Kanada

  • Indie urastają do rangi lidera na kontynencie azjatyckim. Kraj ten odnotował największy przyrost sięgający 192% (tj. wzrost o 2,5 miliona hektarów), przeznaczając pod uprawy biotechnologiczne 3,8 mln hektarów i awansując tym samym o dwa miejsca w światowym rankingu. Indie po raz pierwszy osiągnęły pozycję piątego największego producenta biotechnologicznych roślin uprawnych na świecie -pozostawiając w tyle Chiny

  • Chiny Premier Wen Jiabao powiedział, „aby rozwiązać problem wynikający z niedoboru żywności, musimy oprzeć nasze działania na nauce oraz nowych technologiach, na biotechnologii, na modyfikacjach genetycznych”. Chiny przeznaczyły dodatkowe 3,5 miliarda dolarów na 12 - letnie badania naukowe. Tylko genetycznie zmodyfikowany ryż, na którym prowadzone są doświadczenia polowe, ma ogromny potencjał wpływu na zwiększenie produkcji żywności dla około 440 milionów ludności w kraju oraz wzrost przychodu netto o około 100 dolarów z hektara.

  • Paragwaj

  • Europa: Hiszpania, Portugalia, Niemcy, Polska, Czechy, Rumunia

Najczęściej spotykane rośliny transgeniczne:

  • Soja

  • Kukurydza

  • Bawełna

  • Canola

Cechy:

  • Oporność na herbicydy

  • Na owady

  • Na wirusy

  • Opóźnione dojrzewanie

  • Cech złożone


KONTROWERSJE WOKÓŁ GMO

Produkty biotechnologii i ich zastosowanie budzą wiele kontrowersji. Powszechne są dyskusje, w których ścierają się głosy podkreślające zalety organizmów zmienionych genetycznie (GMOs) z głosami sceptyków uważających, że zagrożenia wynikające z ich upowszechnienia przeważają korzyści.

 Entuzjaści

krop2Wzrost produkcji żywności - upowszechnienie organizmów zmienionych genetycznie pozwoli na zwiększenie produkcji, co ma ogromne znacznie zwłaszcza w krajach rozwijających się. Można to osiągnąć wprowadzając zmiany genetyczne prowadzące do wyższego plonowania, umożliwiające uprawę w niekorzystnych warunkach glebowo-klimatycznych (np. na terenach zasolonych), a także likwidując spadek plonów będący wynikiem chorób i żerowania szkodników.

krop2Ochrona środowiska - wszczepienie genów warunkujących odporność na herbicydy oraz na szkodniki pozwala zmniejszyć zużycie chemicznych środków ochrony roślin, a co za tym idzie ograniczyć zanieczyszczenie środowiska. Ocenia się, że np. uprawa buraków cukrowych odpornych na herbicyd Roundup pozwala na ograniczenie zużycia środków chwastobójczych o 41-59%. Zmiana składu chemicznego roślin pozwala na zrezygnowanie z niektórych technologii w przetwórstwie, wymagających stosowania wielu substancji toksycznych.

krop2Przedłużenie okresu przydatności handlowej płodów rolnych - przykładem mogą być pomidory, które zachowują świeżość do 10 razy dłużej niż normalnie (zerwane w pełni dojrzałości można przechowywać w temperaturze 20-34oC przez 2 miesiące).

krop2Możliwość produkcji tanich leków i szczepionek - wiele substancji cennych z punktu widzenia medycyny jest produkowanych w mleku zwierząt transgenicznych. Prowadzi się też prace nad wszczepianiem roślinom genów warunkujących wytwarzanie białek powierzchniowych wirusów zapalenia wątroby typu B, wścieklizny i biegunek. Wprowadzenie tych białek do organizmu powoduje produkcję przeciwciał zwalczających te choroby.

 Sceptycy

krop2Możliwość niekontrolowanego rozprzestrzenienia się roślin transgenicznych - badania przeprowadzone we Francji wykazały, że transgeniczny rzepak posiadający gen warunkujący odporność na glufozynat amonowy (substancja aktywna herbicydu) może krzyżować się z niektórymi gatunkami spokrewnionych z nim roślin (np. rzodkiew) i przekazywać im ten gen. U roślin potomnych odporność na herbicyd największa była w I pokoleniu, w II zmniejszała się do 82%, a w IV - do 23,5%. Groźba przeniesienia się genów odporności na herbicyd na rośliny, które mogą być chwastami jest więc realna.
Podobne wyniki dały badania przeprowadzone w Danii. Badania przeprowadzone w Niemczech wykazały, że uprawa kukurydzy tradycyjnej na polu przylegającym do pola z kukurydzą transgeniczną prowadzi do zapylenia części roślin tradycyjnych pyłkiem roślin transgenicznych. Na granicy tych pól takiemu zapyleniu podlega 5% roślin, 5 metrów od granicy 0,2%, a 10 metrów od niej - 0,1%.

krop2Możliwość przypadkowego wszczepienia roślinom genu warunkującego cechy zagrażające zdrowiu ludzi - przykładem może być transgeniczna soja uzyskana przez firmę Pioneer Hi-Breed, której wszczepiono geny brazylijskich orzechów w celu zwiększenia zawartości metioniny w nasionach. Cel osiągnięto i zwiększono wartość pokarmową soi, ale jednocześnie przeniesiono z orzechów gen warunkujący produkcję substancji powodującej uczulenia u ludzi.

krop2Ryzyko zwiększenia odporności szkodników stykających się z substancjami chemicznymi wydzielanymi przez rośliny transgeniczne.

krop2Możliwość zwiększenia odporności bakterii na antybiotyki - roślinom transgenicznym zwykle wszczepia się także tzw. gen marker warunkujący odporność na antybiotyk. Celem tego jest możliwość szybkiego wyodrębnienia rośin, u których zabieg wszczepienia się powiódł, poprzez dodanie do odżywki antybiotyku eliminującego rośliny bez obcych genów.
Przeciwnicy inżynierii genetycznej obawiają się, że odporność ta przeniesie się na bakterie, z którymi stykają się rośliny; badania jednak nie potwierdziły takiej możliwości.

krop2Niekorzystny wpływ roślin transgenicznych produkujących substancje zwalczające szkodniki na pożyteczne owady - w Szwajcarii przeprowadzono badania nad wpływem transgenicznej kukurydzy z genem bakteryjnym warunkującym produkcję substancji szkodliwej dla owadów miniarkowatych. Stwierdzono, że dalszą konsekwencją uprawy tej kukurydzy jest zmniejszenie się populacji owadów siatkoskrzydłych. Są one pożyteczne, ponieważ żywią się mszycami.
Badano też ziemniaki i rzepak wydzielające insektycyd zwalczający szkodniki. Stwierdzono, że jest on szkodliwy również dla pszczół, ponieważ występuje między innymi w pyłku. Zabija mszyce, ale także biedronki żywiące się mszycami.

Czynniki określające prawdopodobieństwo przeniesienia genu z roślin GMO do spokrewnionych gatunków

Wprowadzone do roślin uprawnych nowe geny mogą przenosić się przez krzyżowanie na inne rośliny uprawne i gatunki blisko spokrewnione występujące w przyrodzie. W takim wypadku mogą powstać w przyrodzie rośliny (często nazywane super chwastami) tolerujące np. herbicydy. Należy jednak pamiętać, że takie rośliny mogą być łatwo zniszczone poprzez zastosowanie innego herbicydu, ponieważ nowo nabyta cecha związana jest z odpornością na konkretną substancję aktywną. Fakt, że wiele roślin uprawnych jest samopylnych (jęczmień, pszenica) w dużym stopniu ogranicza możliwość przeniesienia nowych genów nawet na inne odmiany uprawne. Rzepak (Brassica napus) jest rośliną obco i owadopylną mającą
w przyrodzie Polski naturalnie występujące pokrewne gatunki (B. campestris i B. oleracea), istnieje więc prawdopodobieństwo przekrzyżowania się z nim rzepaku GM. Większe problemy z uprawą zmodyfikowanego rzepaku wynikają jednak z faktu, że produkuje on bardzo dużo małych nasion, które pozostałe na polu łatwo zimują i mogą kiełkować jeszcze przez wiele lat po zbiorze.

Rośliny transgeniczne Polska

Do krajów uprawiających rośliny transgeniczne w 2007 roku dołączyła Polska. Oficjalnie na polskim rynku nie występują produkty modyfikowane genetycznie. W praktyce zjadamy ich coraz więcej W Polsce rośliny transgeniczne uprawia się - teoretycznie - tylko na polach doświadczalnych. Praktycznie jednak są i uprawy handlowe, bo na oko zmodyfikowanej kukurydzy czy rzepaku nie można odróżnić od roślin naturalnych.


Stan upraw biotechnologicznych w Polsce

Według raportu ISAAA pierwsze komercyjne uprawy roślin genetycznie zmodyfikowanych w Polsce po raz pierwszy zanotowano w 2007 roku, a ich areał wyniósł nieco ponad 300 hektarów. Jedyną genetycznie zmodyfikowaną rośliną dopuszczoną do uprawy na terenie Unii Europejskiej jest kukurydza MON 810 z genem pochodzącym z bakterii glebowej Bacillus thuringensis, tzw. kukurydza Bt, odporna na omacnicę prosowiankę.

Rząd Polski dnia 18 listopada 2008 roku przyjął Ramowe Stanowisko Rządu RP dotyczące Organizmów Genetycznie Zmodyfikowanych (GMO), ustosunkowując się do przepisów prawnych Unii Europejskiej, dopuszczających na terenie UE uprawę transgenicznych odmian kukurydzy. Dokument zawiera stanowisko rządu RP dotyczące:

1. Zamkniętego użycia GMO (modyfikacje genetyczne organizmów, prowadzenie kultur organizmów genetycznie zmodyfikowanych oraz magazynowanie, transport, niszczenie i usuwanie w obrębie zakładu inżynierii genetycznej, lub inne wykorzystanie tych organizmów, podczas którego stosowane są zabezpieczenia w postaci zamkniętej instalacji, zamkniętego pomieszczenia lub innej fizycznej bariery, jak również prace naukowe w systemie zamkniętym).

2. Zamierzonego uwolnienia organizmów genetycznie zmodyfikowanych do środowiska w celach doświadczalnych (bez stosowania zabezpieczeń mających na celu ograniczenie ich kontaktu z ludźmi i środowiskiem, mające na celu określenie wpływu organizmów genetycznie zmodyfikowanych na zdrowie ludzi i na środowisko, pozwalające na otrzymanie wyników dotyczących bezpieczeństwa lub zagrożenia ze strony badanego organizmu).

3. Wprowadzenia do obrotu GMO jako produktów lub w produktach (produkty GM dopuszczone do obrotu na terenie UE mogą być użytkowane i wykorzystane we wszystkich gałęziach przemysłu, z wyłączeniem stosowania ich jako żywność lub pasza, przy czym dopuszczenie każdego produktu jest rozpatrywane indywidualnie). Produkty GM dopuszczane do obrotu jako pasza lub żywność muszą być znakowane, przy czym zgodnie z traktatową zasadą swobodnego przepływu towarów Polska nie może zabronić na swoim terytorium obrotu żywnością i paszami GM, umieszczonymi na rynku UE zgodnie z decyzją Komisji Europejskiej. Obecnie w Rejestrze żywności GM i Pasz GM zarejestrowane jest ok. 25 rodzajów modyfikacji.


Rząd Polski opowiada się przeciwko wprowadzeniu do obrotu z możliwością uprawy roślin GM i uczestnicząc w procedurze autoryzacji i biorąc udział w głosowaniach na forum UE będzie wyrażał stanowisko negatywne głosując przeciwko wprowadzaniu do obrotu i uprawy nowych roślin genetycznie zmodyfikowanych.

Według Ramowego Stanowiska Rządu RP dopuszcza się prowadzenie prac zamkniętego użycia GMO, ale opowiada się przeciwko zamierzonemu uwalnianiu GMO do środowiska w celach doświadczalnych. Zasadne jest prowadzenie przez jednostki naukowe i szkoły wyższe doświadczeń mających na celu uzyskanie wyników rolno-środowiskowych dotyczących wpływu GMO na środowisko.

Rząd Polski chcąc, aby Polska uzyskała status kraju wolnego od GMO. Opowiada się przeciwko wprowadzaniu GMO do obrotu jako produktów i w produktach, oraz przeciwko wprowadzeniu do obrotu z możliwością uprawy roślin genetycznie zmodyfikowanych.

W roku 2008 areał upraw roślin genetycznie zmodyfikowanych wzrósł w Unii Europejskiej o kolejne 21%, osiągając powierzchnię 107,719 ha. Największy wzrost obszaru upraw tego typu zanotowano w Rumunii (1942%), natomiast w Polsce wzrost ten wyniósł 838% (3 000 ha) (EuropaBio). Obecnie na terenie UE do uprawy dopuszczona jest tylko kukurydza MON 810, zostały jednak złożone wnioski na wprowadzenie do uprawy kolejnych 8 roślin GM, m.in. kukurydzy odpornej na szkodniki z rzędu Lepidoptera (motyle) i na glifosat, kukurydzy odpornej na glifosat, kukurydzy odpornej na szkodniki z rzędu Coleoptera (chrząszcze) i glufosynat amonowy, soi odpornej na glufosynat amonowy. Według przewidywań ISAAA obszar upraw genetycznie zmodyfikowanych będzie wzrastał, głównie ze względów ekonomicznych, lecz także ekologicznych.

Oznaczanie produktów GMO

Zgodnie z art. 13 rozporządzenia 1829/2003, na etykiecie produktu spożywczego,

który zawiera lub składa się z GMO, jest wyprodukowany lub zawiera składniki wyprodukowane z GMO powinna być umieszczona jedna z następujących informacji:

‘genetycznie zmodyfikowany’,

‘wyprodukowany z genetycznie zmodyfikowanej (nazwa organizmu np. kukurydzy)’,

‘zawiera genetycznie zmodyfikowany (nazwa organizmu np. rzepak)’,

‘zawiera (nazwa składnika np. olej) wyprodukowany z genetycznie zmodyfikowanej

(nazwa organizmu np. kukurydzy)’,

Z wikipedii

Produkty GMO

Szczególne obowiązki w zakresie oznaczania produktów dotyczą tzw. produktów GMO. Jako produkt GMO to każdy wyrób składający się z GMO lub zawierający GMO lub ich fragmenty lub kombinację GMO, który jest wprowadzany do obrotu lub wywożony za granicę lub przewożony tranzytem przez terytorium Rzeczypospolitej Polskiej GMO, czyli organizmy genetycznie zmodyfikowane.

Istnieje obowiązek znakowania produktów GMO, z wyjątkiem, gdy ich zawartość w produkcie nie przekracza 1% masy. Oznakowanie produktu GMO, które powinno znajdować się na etykiecie, zawierać musi następujące informacje:

  • nazwę produktu GMO i nazwy zawartych w nim GMO,

  • imię i nazwisko lub nazwę producenta lub importera oraz adres,

  • przewidywany obszar stosowania produktu GMO: Przemysł, rolnictwo ,leśnictwo powszechne użytkowanie przez konsumentów lub inne specjalistyczne zastosowanie,

  • zastosowanie produktu GMO i dokładne warunki użytkowania wraz z informacją, w uzasadnionych przypadkach, o rodzaju środowiska, dla którego produkt jest odpowiedni,

  • szczególne wymagania dotyczące magazynowania i transportu, jeżeli zostały określone w zezwoleniu,

  • informacje o różnicy wartości użytkowej między produktem GMO a jego tradycyjnym odpowiednikiem

  • środki, jakie powinny być podjęte w przypadku niezamierzonego uwolnienia GMO, niezgodnego z wymaganiami dotyczącymi wprowadzenia produktu GMO do obrotu, jeżeli zostały określone w zezwoleniu,

  • numer zezwolenia.

W przypadku gdy cały produkt jest genetycznie zmodyfikowany, oznakowanie powinno być uzupełnione informacją: produkt genetycznie zmodyfikowany. Jeśli tylko niektóre składniki są genetycznie zmodyfikowane, obok nazwy składnika należy umieścić napis "genetycznie zmodyfikowany". Napis i informacja powinny być czytelne i zapisane czcionką tej samej wielkości co nazwa składnika lub produktu. Brak odpowiedniego oznaczenia produktu GMO stanowi wykroczenie i jest zagrożone karą grzywny.

25. RODZAJE KONSTRUKCJI GENOWYCH

Konstrukcje genowe inaktywujące (knock-out)- zadaniem jest uszkodzenie funkcji genu występującego w organizmie, najczęściej jest to przerwanie ciągłości genu, badania tego typu w największej ilości wykorzystano na myszach, w ten sposób poznano funkcję wielu genów

Konstrukcje genowe modyfikujące genom (knock-in)- jej zadaniem jest nadanie biorcy nowych właściwości, są to przeważnie całe geny bądź cDna, takie konstrukcje wykorzystano u roślin, zwierząt i bakterii u człowieka nie bo terapia genowa nie jest na takim poziomie

Konstrukcje genowe regulatorowe (knock-in)- ich zadaniem jest wpływanie na ekspresje trans genu lub hamowanie funkcji organizmu biorcy, stosuje się u roslin, zwierząt i bakterii, np. wprowadzenie genu, hormonu, czynnika transkrypcyjnego, to co może potem wpływać na regulację ekspresji


26. MECHANIZMY WŁĄCZANIA KONSTRUKCJI GENOWYCH DO GENOMU

Rekombinacja homologiczna- reakcja wymiany pomiędzy DNA chromosomalnym, o obcą nowo wprowadzaną sekwencją. Rekombinacja homologiczna oznacza wymianę pomiędzy fragmentami DNA o podobnym składzie zasad, sekwencje konstrukcji leżące poza regionem homologii do genu endogennego zostają usunięte. Konstrukcja genowa zawiera marker selekcyjny i sekwencję która chcemy wprowadzić. Marker selekcyjny przerywa ciągłość genu biorcy więc jest to też konstrukcja inaktywująca.

schemat rek. homo1.jpg


Konstrukcja insercyjna- dodaje swoje sekwencje do genu endogennego powodując podwojenie i uszkodzenie normalnej struktury genu

Konstrukcja wymienna- podstawiają swoje sekwencje w miejsce endogennego genu

Przypadkowa integracja- zachodzi w sposób niezwiązany z genami homologicznymi u biorcy, nie dochodzi do wymiany fragmentów genu, lecz do wbudowania całej konstrukcji genowej, mogą to być konstrukcje modyfikujące lub regulatorowe, nie można przewidzieć ani kontrolować, może okazać się, że wbudowany gen nie będzie ulegał ekspresji

Przykłady konstrukcji:
konstrukcja inaktywująca alergeny kota
a) gen kinazy tymidyny
b) fragment genu Feld 1
c) kaseta (?) neomycynowa
d) fargm. Genu Feld 1

B i c- regiony homologiczne, po wniknięciu do komórki mogą odszukać regiony biorcy i się z nimi połączyć, kaseta neomycynowa zostanie włączona i gen zostaje wyłączony

Konstrukcja modyfikująca
a) promotor WAP
b) wstawka histydynowa- 6 reszt histydyn
c) gen alergenu
d) region PoliA
e) mamy gen aktywny- kwaśne mleko serwatki

Po wprowadzeniu do organizmu nastąpi synteza alergeny Feld 1 w formie nieaktywnej. Histydyny będą służyły do wyizolowania alergeny metodą chromatografii powinowactwa.

Konstrukcje genowe terminatora-
a) promotor LEA/ sekwencja LOX/ sekwencja blokująca/ sekwencja LOX/ gen zmieniający fenotyp
b) promotor 35S + 3x operon tet
c) promotor aktywny/ gen kodujący rep resor tet

  • Promotor oddzielamy od genu- Gen nieaktywny (zbyt duża odległość pomiędzy promotorem a genem)

Działanie w komórce:
dodatek induktora → związanie represora → brak blokady promotora 35S → gen CRE aktywny → wycięcie sekwencji blokującej → zbliżenie promotora LEA i genu RIP → aktywność genu RIP → ekspresja geny RIP → brak kiełkowania nasion


Konstrukcja ekspresyjna- konstrukcja wprowadzająca do genomu naturalnie nie występujący gen


Projektowanie struktury konstrukcji genowej:
- promotor ogólnoustrojowy lub tkankowo specyficzny
-region ulegający transkrypcji, struktura stabilizująca 5’, poliadenylacja
-5’ UTR- struktury wiążące rybosom (IRES), elementy regulatorowe, upORF, region oligopirymidynowy
-region kodujący- sekwencja typu kozak, optymalizacja kodonów, sekwencja sygnałowa, wzmacniacze wewnątrzeksonowe
-introny, wewnątrzintronowe elementy wzmacniające poziom ekspresji
-3’ UTR sekwencja poliA, elementy ARE i PRE, terminator transkrypcji
-regiony połączenia z matrix jądrową MAR i kontrolujące locus LCR


Stabilna transformacja komórki roślinnej (I-III elementy konstrukcji?)

  1. Sekwencje dna obejmującą gen, którego ekspresja zmienia fenotyp i promotor o przejściowej aktywności. Gen i promotor stanowią funkcjonalną jednostkę lecz rozdzielone są sekwencją blokującą, którą z kolei flankują sekwencje wycinania. Obecność sekwencji blokującej hamuje ekspresje

  2. Sekwencję obejmującą gen kodujący rekombinazę specyficzną dla sekwencji wycinanych i promotorem represyjnym

  3. Sekwencję obejmującą gen represora dla promotora represyjnego drugiej sekwencji. Sekwencja dołączona jest do promotora aktywnego w roślinie

  • Wprowadzenie do sekwencji blokującej trzeciej sekwencji

  • Promotor o przejściowej aktywności wybierany jest z promotorów aktywnych w późnej embriogenezie, powstawaniu nasion, kwiatów, liści, korzeni, ukł. Przewodzącego, promotorów aktywnych w warunkach stresu i po ekspozycji na metale ciężkie

  • Gen I jest wybrany z grupy: gen letalny, gen insektycydu, gen fungicydu, gen bakteriocydu, gen oporności na antybiotyki, gen wpływający na metabolizm

  • Sekwencje sygnałowe wybrane są z grupy LOX i sekwencji rozpoznawanych przez lipazę, resolnazę(?!), FLP, integrazę lub transpozazę

Re-aranżacje DNA w wyniku transgenezy- jak ktoś znajdzie to może uzupełnić


27. Transgeneza zwierząt

Transgeneza zwierząt stała się w ostatnich latach przedmiotem zainteresowania laboratoriów biotechnologicznych na całym świecie. Transgenezę można przeprowadzać kierując się celami biomedycznymi jak i celami użytkowymi. Wśród celów użytkowych zwraca się uwagę na poprawę właściwości produktów nabiałowych, mięsa i produktów mięsnych oraz pozyskiwanie wełny, poprzez wpływ na odporność na choroby, trawienie i metabolizm, skład mleka, przyrost wełny i tuszy czy rozmnażanie zwierząt. Część biomedyczna obejmuje uzyskiwanie białek o znaczeniu farmaceutycznym, badanie mechanizmów chorób człowieka (włączanie, wyłączanie genów), wykorzystanie ksenogenicznych komórek i tkanek, jak i ksenotransplantację organów, przy czym obecnie wykorzystywana jest głównie biosynteza białek. Ponadto transgeniczne zwierzęta dostarczają bardzo ważnych informacji dotyczących regulacji ekspresji genów umożliwiając śledzenie procesów strukturalno-funkcjonalnych oraz związków przyczynowo-skutkowych w patofizjologii.
Transgeneza związana jest ze zmianą aktywności genów występujących w danym organizmie, wprowadzeniem do organizmu dodatkowych kopii jego własnego genu lub obcego (np. zwielokrotnienie pożądanej cechy i przyspieszenie wzrostu) - poprzez wprowadzenie konstrukcji genowych konkurencyjnych, inaktywujących lub regulatorowych albo poprzez wprowadzenie konstrukcji ekspresyjnej zawierającej nie występujący naturalnie gen. Konstrukcje genowe można wprowadzać stosując infekcje wirusowe, biolistykę, metody fizyko-chemiczne obejmujące destabilizację błon, elektroporację, lipofekcję lub mikroiniekcję. Jeśli proces transgenezy jest w pełni udany, należy oczekiwać uzyskania obcych białek w mleku, moczu, krwi, nasieniu czy jajach ptaków oraz uzyskania organów do przeszczepów.

Cele genetycznej modyfikacji zwierząt

W 1980 roku po raz pierwszy uzyskano transgeniczne zwierzę, była to mysz. Od tamtej pory liczba zwierząt poddawanych genetycznym ulepszeniom zwiększa się i służy dwóm celom. Pierwszy z nich jest czysto naukowy (poznawczy), ma on na celu poznanie genetycznej kontroli systemów fizjologicznych zwierząt i człowieka oraz opracowanie modeli chorób genetycznych. Kolejnym jest cel praktyczny, który obejmuje poprawę cech użytkowych, biomedyczne wykorzystanie produktów uzyskanych ze zwierząt genetycznie zmodyfikowanych, które występują tu jako bioreaktory.
Cel naukowy (poznawczy), jako model wykorzystuje w swoich badaniach np. myszy, których pełna sekwencja genomu została poznana w 2002 roku. W badaniach medycznych myszy przybliżyły naukowców do odpowiedzi na pytania o otyłość, cukrzycę, karłowatość, choroby układu krążenia, są również świetnym modelem do testowania nowych metod leczenia. Myszy, którym wszczepiono dodatkowy gen, lub te którym go usunięto (nokaut genu) wniosły bardzo wiele w poznanie procesów nowotworzenia, podziału komórek i rozwoju organizmu.
Praktyczny cel tworzenia zwierząt genetycznie zmodyfikowanych, to głównie:

1. Szybsze i kontrolowane rozmnażanie,
2. Lepsze wykorzystania paszy,
3. Większa odporność zwierząt na choroby i pasożyty (np. odporność kur na wirusa ptasiej grypy, odporność krów na priony powodujące BSE, czyli tzw. „chorobę szalonych krów”),
4. Wykorzystanie zwierząt w celach biomedycznych:
- Otrzymywanie białek o znaczeniu farmaceutycznym,
- Wykorzystanie ksenogenicznych organów i tkanek,
- Ksenogeniczne organy do transplantacji,
5. Poprawa jakości produktów żywnościowych:
- Większy przyrost i lepsza jakość wełny,
- Większy przyrost tuszy i lepsza jakość mięsa, efekt ten uzyskano po wprowadzeniu genu produkującego hormon wzrostu m.in. do karpia, królika, świni,
- Większa wydajność i jakość mleka. Wydajność została osiągnięta przez wprowadzenie genu kodującego proteiny, beta-, kappa- kazeinę.


Cele inżynierii genetycznej komórek zwierzęcych:

  • potwierdzenie, że wyizolowane (badane) geny kierują syntezą określonych białek lub są odpowiedzialne za określone czynności fizjologiczne

  • ocena wpływu wprowadzonej mutacji

  • uzyskiwanie (izolacja) genów odpowiedzialnych za syntezę określonych białek

  • analiza konsekwencji fizjologicznych ekspresji specyficznych białek

  • badanie wpływu leków (efektorów)

  • produkcja zwiększonych ilości białek, które występują w niewielkich ilościach

Główne cele badań aplikacyjnych:

  • wybór wartościowych białek

  • wybór docelowej tkanki do transgenezy

  • wybór gatunku zwierzęcia do transgenezy

      • wydajność produkcji (ilość/rok)

      • potencjał hodowli i przetwarzania

      • wykorzystanie rekombinowanych białek

      • Czas potrzebny do uzyskania i przetwarzania mleka

Produkcja rekombinowanych białek

Produkcja białek rekombinowanych in vitro jest  szeroko stosowana zarówno do celów naukowych, jak i terapeutycznych. Łatwa procedura i niskie koszty powodują, że systemy bakteryjne i drożdżowe to najczęściej stosowane systemy ekspresyjne. Metoda ta jednak wymaga wiedzy i doświadczenia w celu osiągnięcia zadowalających rezultatów. Jakość i ilość końcowego produktu zależą zarówno od zastosowanego wektora ekspresyjnego czy szczepu, jak i od odpowiednio dobranych warunków wzrostu hodowli i oczyszczania.

Dziś w dużym stopniu wykorzystywane są bakterie do produkcji białek leczniczych, w mniejszym stopniu są to komórki ludzkie hodowane in vitro z powodu wysokich kosztów. Lecz nie wszystkie białka mogą wziąć swój początek w hodowli komórek bakteryjnych, a wysokie koszty eliminują ludzkie kultury in vitro. Dlatego przyszłość dla takich białek tkwi w roślinnych bądź zwierzęcych bioreaktorach



Bakterie

Drożdże

Grzyby

Rośliny

Kultury tkankowe

Zwierzęta

Szybkość

++++++

++++

+++++

++

+++

+

Koszt

++++

++

+++

++++++

+

+++++

Modyfikacje potranslacyjne

+

++

+++

++++

++++++

+++++

Skalowanie procesu

++++

++

+++

++++++

+

+++++

Przepisy

+++++

++++

+++

++

++++++

+



System uzyskiwania rekombinowanych białek

  • krew

  • mocz

  • płyn nasienny

  • białka jaja

  • jedwabniki

  • mleko

    • Gruczoł mlekowy

      • dodawanie wartości (wzrost poziomu kazein w produkcji serów)

      • poprawa wartości odżywczych (humanizowane mleko)

      • produkcja białek do leczenia lub zapobiegania chorobom człowieka

      • synteza biomateriałów (kolagen, białka pajęczyny)


        • Króliki (IGF – 1 człowieka, interleukina 2, tkankowy aktywator plazminogenu, chymozyna, erytropoetyna,  glukozydaza, czynnik NGF - , białko C, hormon wzrostu człowieka)

        • Kozy (tkankowy aktywator plazminogenu człowieka, antytrombina III człowieka, przeciwciała monoklonalne człowieka, hormon wzrostu)

        • Owce (czynnik VIII krzepliwości krwi, IX,  1 antytrypsyna człowieka, fibrynogen)

        • Świnie (białko C, czynnik VIII krzepliwości krwi)

        • Krowy (laktoferyna człowieka, erytropoetyna człowieka, albumina człowieka)

    • Krew

      • łatwo dostępne i tanie źródło białek

      • brak trwałości i szybkie usuwanie z krwioobiegu białek o znaczeniu terapeutycznym

      • aktywność białek – wpływ na fizjologię zwierząt

      • króliki ( 1 – antytrypsyna człowieka, przeciwciała monoklonalnna)

      • świnie (przeciwciała monoklonalne, hemoglobina człowieka)

    • Białko jaj

      • doskonałe źródło rekombinowanych białek

      • bardzo duże możliwości reprodukcyjne (kilkaset sztuk potomstwa rocznie)

      • krótki odstęp międzypokoleniowy (ok. 7-8 m-cy)

      • niskie koszty hodowli drobiu

      • problemy techniczne: mikroiniekcja egzogennego DNA do zapłodnionych jaj, modyfikacja pluripotentnych komórek blastodermalnych, wektory retrowirusowe)

      • biologiczna aktywność, prawidłowo glikozylowany interferon  2b człowieka

      • przygotowanie ekspresji białka C1 (dziedziczny obrzęk naczyniowo – ruchowy)

    • Jedwabniki

      • jedwabniki morwowe (Bamyx mori) – naturalny producent jedwabiu dla przemysłu włókienniczego

      • kokon – potencjalne źródło dużych ilości rekombinowanych białek

      • krótki czas zwiększania liczebności jedwabników

    • Nasienie

      • obfitość i łatwość pozyskiwania u niektórych gatunków zwierząy np. świń

      • bardzo duża wydajność syntezy białek

      • myszy (hormon wzrostu człowieka)

    • Mocz

      • produkcja u wszystkich osobników przez cały okres życia

      • obniżenie kosztów

      • myszy (hormon wzrostu człowieka, erytropoetyna człowieka,  - 1 antytrypsyna człowieka


Etap

Mysz

Królik

Świnia

Owca

Bydło

Zebranie, mikroiniekcja, przeniesienie zarodków

1

1

6

6

12

Poród zwierząt F0

0,75

1

4

5

9

Okres generacji (narodziny zwierząt F1)


2,5

6

12

18

30

Dostępność transgen. homozygot pok. F2 do rozmnażania

3,25

6

12

23

39

Wykorzystanie zwierząt pokolenia F3

2,5

6

12

18

30

R A Z E M

10

20

50

70

130


Okres potrzebny do uzyskania transgenicznych zwierząt (dane w miesiącach)

Wydajność transgenezy

Najbardziej obiecujące wyniki uzyskano w przypadku królików.



Mysz

Królik

Świnia

Owca

Bydło

l. oocytów do iniekcji na superowulowaną dawczynię D

15

20

15

4

5

l. dawczyń na biorczynię B

2

2

2

1,5

1

Ciąże

60%

50%

40%

40%

20%

Zwierzęta uzyskane z zarodków poddanych mikroiniekcji

10-20%

10%

5%

15%

10%

Wydajność integracji

15%

10%

10-15%

5-10%

5-10%

Transgeniczne zwierzę/ oocyty poddawane mikroiniekcji

2%

1%

0,5%

1%

0,5%

l. zwierząt D+B przypadająca na transgeniczne zwierzę

10

15

20

40

80


Etapy pracy przy uzyskiwaniu transgenicznych ssaków

  1. Klonowanie genu

  2. Przygotowanie roztworu DNA do mikroiniekcji

  3. Przygotowanie oocytów i zarodków

  4. Mikroiniekcja DNA do przedjądrza

  5. Transfer zarodków do zwierząt

  6. Delecja transgenu u nowonarodzonych zwierząt


ad. 1 Klonowanie genu

Dna jest identyczne u eukariotów i prokariotów (wyjątek mitochondrialne DNA). Syntetyzowane DNA, klonowane DNA i fragmety chromosomów mogą być integrowane z genomem gospodarza z tą samą częstotliwością. Wielkość podawanego DNA limitują wektory (do 20kz), komórki mogą przyjąć 1 Mpz DNA. Liniowe DNA integrują 5x lepiec niż koliste. Częstość integracji w oocytach myszy do 25 %. Komórka najbardziej aktywna modyfikuje i rozpoznaje „obcy” DNA w czasie pierwszych 24 h. Konstrukcje genomowe wykazują przewagę nad cDNA. Sekwencja TATA, inicjatory (INR), m-ce cap, sekwencja AATAAA i G/T (za genem), promotor, wzmacniacz, wyciszacz.

- dużo zabiegów przebiega przez PCR


ad. 2 Przygotowanie roztworu DNA do mikroiniekcji

Izolacja plazmidów, wycinanie insertów, oczyszczanie insertów, wytrącenie EtOH, rozpuszczenie w buforze do iniekcji (TE, pH 7,5), stężenie 1g/ml (kilkaset kropli DNA w 1 pl). Roztwór DNA musi być czysty i sterylny.


ad. 3 Przygotowanie oocytów i zarodków

Pobranie – zabieg chirurgiczny, wypłukanie z jajnika

oocyty „lubią” ciepło


Organizm

Czas

Hormon

Zapłodnienie

Pobranie

l. oocytów

Mysz

3d

PMSG, HCG

N

48h

15-30

Królik

4d

PMSG, HCG

N/S

1h

25

Świnia

133h

PMSG, HCG

2 x S

26h

30-35

Owca

17d

FSH

S

48h

5

Koza

8d

FSH

4 x N

72h

6

Krowa

9d

PNSG

2 x S

24h

12



ad. 4 Mikroiniekcja DNA do przedjądrza

Oprzyrządowanie wysoce wyspecjalizowane. Konieczne jest specjalistyczne szkolenie. Średnica kapilary 1m, obj. DNA 1-2 pl. Natychmiast po iniekcji przenosi się oocyty do podłoża (37-29oC). Przedjądrza często nie są widoczne, można je przesunąć przez wirowanie. Najlepiej przenosić do przedjądrza męskiego (większe).


ad. 5 Transfer zarodków do zwierząt.

Transfer najczęściej po kilku godzinach, do zsynchronizowanych zwierząt. Czasem wskazana krótka hodowla (3-7 dni). Transfer chirurgiczny.


ad. 6 Detekcja transgenu u nowonarodzonych zwierząt

Analiza DNA 3-6 tygodni po urodzeniu. Izolacja wysokocząsteczkowego DNA (25-35 kpz). Hybrydyzacja, PCR, hybrydyzacja in situ.

Metody niewirusowego przenoszenia DNA

  • precypitacja fosforanem wapnia

  • DEAE – dekstran

  • lipofekcja

  • elektroporacja

  • fuzja protoplastów

  • laser

  • mikroiniekcja

    • Elektroporacja i elektroforeza


      • w elektroporacji dochodzi do rozładowania kondensatora perforującego przez błony komórkowe, 1ms, 700V/cm. Perforacja jest przejściowa, lecz wystarczająca do przejścia DNA do komórki

      • w elektroforezie (elektrofekcja) DNA migruje w polu elektrycznym, przechodząc do komórki

      • elektroporacja stosowana jest już rutynowo, a elektroforeza jedynie sporadycznie

      • elektroporacji można poddać nie tylko protoplasty, lecz całek komórki, skrawki tkanek

    • Biolistyka

      • wprowadzenie do całych komórek i tkanek makrocząsteczek pokrytych DNA za pomocą mikrowyrzutni. Najczęściej - metalowe kulki o średnicy 0,2-2m. Wyrzut  prochem strzelniczym, wysokim ciśnieniem lub rozładowanie elektryczny. Kuleczki wolframu lub złota pokryte są DNA w ten sposób, aby DNA zatrzymał się w komórce. Dochodzi do okresowej, przemijającej ekspresji lub trwałego wbudowania w genom. Tą techniką uzyskano transformowane rośliny odporne na infekcję Agrobacterium np. sorgo, owies, pszenica, ryż, soja, kukurydza. Możliwa jest również transformacja organelli. Komórki bombardowane są w fazie G2 i M dają 4-6 razy wyższą transformację.

    • Laser mikrowiązkowy

      • komórki umieszcza się w pożywce hipertonicznej, a następnie perforuje laserem, co prowadzi do pobrania DNA. DNA ulega przejściowej ekspresji.

    • Włókna silikonowe

      • włókna miesza się intensywnie z komórkami i DNA. Dochodzi do wielokrotnego uszkodzenia błon komórkowych i wprowadzenia do komórki DNA. Mechanizm zjawiska nie jest w pełni wyjaśniony. Zalety to prostota i transformacja komórek. Wady – duża śmiertelność

    • Mikroiniekcja

      • komórki muszą być unieruchomione w agarozie lub aligininie sodu. Zaletą – możliwość obserwacji mikroiniekcji pod mikroskopem, wadą niewielką liczba komórek, które można jej poddać ( 100 kom/h)

      • jedyna metoda wprowadzenia DNA do protoplastów, komórek i zygot

      • wymaga dużej wprawy

    • Liposomy

      • system zbliżony do Agrobacterium – zabezpieczenie DNA przed enzymami. Stosuje się liposomy LUV. Dochodzi do fuzji liposomów z plazmalemmą. Lipofekcja.

Czynniki wpływające na ekspresję transgenów

  1. Stabilność DNA

  2. Zachowanie integralności

  3. Topologia DNA. Liniowy czy kolisty?

  4. Stan fizjologiczny komórek. Otoczenie

  5. Przygotowanie wektora dla przejściowej ekspresji.

Czynniki wpływające na ekspresję genów kodujących białka

  1. Wydajność transkrypcji (metylacja DNA, elementy modulujące)

  2. Dojrzewanie i transport RNA (caping, splicing, poliadenylacja)

  3. Okres życia RNA (długość poli A, degradacja)

  4. Wydajność translacji (struktury wyższych rzędów)

  5. Stabilność białka (transport, aktywność)

Czynniki wpływające na transkrypcję

  1. Sekwencja TATA (TATA box) –25 do –35

  2. Inicjatory (INR) m-ce cap

  3. Sekwencja AATAAA i G/T za genem

  4. Promotor –40 do –400

  5. Wzmacniacz (enhancer) przed lub za genem do 10kpz

  6. Wyciszacz (silencer) przed i za genem


28. TRANSGENEZA I KLONOWANIE ZWIERZĄT


Projektowanie struktury konstrukcji genowej:

  • Promotor – ogólnoustrojowy lub tkankowo – specyficzny,

  • Region ulegający transkrypcji – struktura stabilizująca 5’; poliadenylacja,

  • 5’ UTR – struktura wiążąca rybosom (IRES), elementy regulatorowe, np.ORF, region oligopirymidynowy,

  • Region kodujący – sekwencja typy Kozak, optymalizacja kodonów, sekwencja sygnałowa, wzmacniacze wewnątrz eksonowe,

  • Introny – wewnątrz intronowe elementy wzmacniające, poziom ekspresji a introny,

  • 3’ UTR – sekwencja poli(A), elementy ARE i PRE,

  • Terminator transkrypcji,

  • Regiony połączenie z matrix jądrową (MAR) i kontrolujące lacus(LCR).


5’-MAR-LCR-elementy wzmacniające-promotor-5’UTR-intron-3’UTR


Uzyskiwanie zwierząt transgenicznych:

  • Klonowanie genu,

  • Przygotowanie roztworu DNA do mikroiniekcji,

  • Przygotowanie oocytów i zarodków,

  • Mikroiniekcja DNA do przedjądrza,

  • Transfer zarodków do zwierząt,

  • Detekcja transgenu i nowourodzonych zwierząt.


Oczyszczanie rekombinowanego białka(np. hormonu wzrostu człowieka):

  • zastosowanie chromatografii powinowactwa.

Biologiczna aktywność oczyszczonego białka:





Klonowanie zwierząt, przykłady:

  • Zwierzęta laboratoryjne

    • Mysz

    • Królik

    • Mucha owocowa

  • Zwierzęta gospodarskie:

    • Owca

    • Koza

    • Świnia

    • Bydło

    • Konie


Klonowanie somatyczne:


Dojrzały oocyt


Enukleacja


Enukleowany oocyt Hodowla fibroblastów


Transfer transgenicznego fibroblastu i fuzja


Krótkotrwała hodowla zarodka


Wprowadzenie do matki zastępczej



Klonowanie blastomerowe:


Komórka jajowa królika


Zapłodnienie naturalne


Enukleacja jednego blastomeru w dwublastomerowym zarodku


Transfer jądra transgenicznego fibroblastu i fuzja


Krótkotrwała hodowla


Wprowadzenie do matki zastępczej


Sprawdzanie rekombinowanego białka:

  • Czy jest ta sama wielkość

  • Rozpoznawanie przeciwciałem

  • Aktywność biologiczna – zależne od danego białka→mogą dać sygnał

  • Badania kliniczne


Korzystne cechy kóz – przejście do większych zwierząt gospodarczych:

  • Stosunkowo duża ilość mleka do uzyskania

  • Niższe koszty utrzymania i transgenezy

  • Można przygotować w ciągu kilki lat

  • Konstrukcja genowa pblGTNF:

  • Promotor β – laktoglobuliny

  • sekwencje kodujące i miejsce rozpoznające enterokinazę

  • Gen ludzkiego czynnika martwicy nowotworu

  • Sekwencja poli(A)

  • Gen markerowy, np. GFP – zielonego białka fluoryzującego(ten gen ma też promotor)

  • Wzmacniacz

  • Białko GFP

  • Sekwencja kodująca poli(A)


Wielkość: 6,7 kilozasad



29. WPROWADZENIE INFORMACJI GENETYCZNEJ DO PROKARIOTA


Koniugacja bakterii

Koniugację prowokują plazmidy F (fertility factor), które mogą:

- replikować się i rozchodzić do obu potomnych komórek bakterii

- syntetyzować pili (l. poj. pilus), małe białkowe rurki, które odszukują inną komórkę, przyczepiają się do niej, a potem skracając się przyciągają komórki do siebie

- przez te rurki przechodzi kopia plazmidu od dawcy (F+) do biorcy, w której go jeszcze nie ma (F-)

- jeżeli plazmid jest wczepiony do chromosomu bakterii dawcy to przechodząc do biorcy przeciąga jego fragment; dawca ginie a jego geny mogą ączyć się w genom biorcy; proces taki zachodzi stosunkowo często, dlatego szczepy takie nazywamy Hfr (high frequency of recombination).


Transformacja u bakterii

a) Transformacja to pobranie ze środowiska nagiego DNA i zmiana fenotypu na skutek wbudowania i odczytania zawartej tam informacji genetycznej.

b) Wiele bakterii, np. Haemophilus, Bacillus, mogą ulegać transformacji spontanicznie, a nawet pobierać DNA aktywnie ze środowiska.

c) Escherichia nie transformuje naturalnie, ale można sztucznie osłabić jej ścianę komórkową pomagając w przejściu DNA, wykorzystuje to inżynieria genetyczna.


Transdukcja u bakterii

Wirusy bakteryjne to bakteriofagi lub fagi. Mają własne geny umożliwiające replikację ich DNA (lub RNA) oraz produkcję powłok białkowych, ale mogą się rozmnażać tylko wewnątrz komórek, wykorzystując ich metabolizm Fagi lityczne namnażają się intensywnie po wejściu do komórek i doprowadzają do jej rozpadu, czyli lizy komórki. Fagi lizogeniczne, np. pokazany obok fag lambda, mogą wbudować swój DNA do chromosomu bakterii i w tej ukrytej formie profaga dzielić się wraz z nim, zanim nastąpi produkcja fagów potomnych i rozpad komórki.

Transdukcja to przeniesienie genów z jednej bakterii do drugiej przez faga (litycznego lub lizogenicznego) poprzez przypadkowe uwięzienie fragmentów genomu gospodarza w powłoce białkowej faga.

W transdukcji niespecyficznej zapakowaniu do faga ulegają przypadkowe odcinki chromosomu;

W transdukcji specyficznej pobierane są określone odcinki chromosomu, te gdzie wbudowuje się profag

Koniugacja, transformacja i transdukcja to trzy drogi horyzontalnego transferu genów

pomiędzy różnymi bakteriami i pomiędzy ich genomowymi pasożytami, a zapewne też

pomiędzy gospodarzami bakterii

Ruchome elementy genetyczne bakterii

Sekwencje insercyjne, IS, to krótkie (800-1200 b) fragmenty DNA, zawierające gen transpozazy otoczony odwracalnymi sekwencjami powtarzalnymi; komórki Escherichia mają zazwyczaj po kilka ich rodzajów w kilku kopiach. Przemieszczają się one z jednego miejsca chromosomu do innego replikatywnie (pozostawiają kopię

w starym miejscu) lub konserwatywnie (kopia w starym miejscu zanika) Konsekwencją ich przemieszczania

się są mutacje; wbudowując się (często).


Transpozony to sekwencje insercyjne otaczające inne geny, takie jak oporności na antybiotyki, metale ciężkie, i

wiele innych enzymów; zmieniają one fenotyp bakterii poprzez ekspresję tej informacji, ale mogą też powodować mutacje, gdy umieszczą się w innym genie Transpozony przzenoszą geny oporności na antybiotyki lub metale ciężkie, i wiele innych enzymów; zmieniają one fenotyp bakterii poprzez ekspresję tej informacji, co dla gospodarza może być korzystne, ale mogą też powodować szkodliwe mutacje mutacje, gdy umieszczą się w czynnym genie.

Mogą wstawiać się zarówno w chromosomy, fagi, jak i plazmidy, i dlatego są znakomitym pośrednikiem w

horyzontalnym transferze genów między szczepami bakterii; plazmidy przenoszące po wiele oporności na

antybiotyki na raz, jak ten z prawej, są zmorą współczesnej medycyny.


30. GRUCZOŁ MLEKOWY JAKO BIOREAKTOR


Systemy do uzyskiwania rekombinowanych białek

  • Krew

- łatwo dostępna i tanie źródło białek

- brak trwałości i szybkie usuwanie z krwioobiegu białek o znaczeniu terapeutycznym

- aktywność białek – wpływ na fizjologię zwierząt

- króliki (1-antytrypsyna człowieka, przeciwciała monoklonalne)

- świnie (przeciwciała monoklonalne, hemoglobina człowieka)

  • Mocz

- produkcja u wszystkich osobników przez cały okres życia

- obniżenie kosztów

- myszy (hormon wzrostu człowieka, erytropoetyna człowieka, -1-antytrypsyna

człowieka

  • Płyn nasienny

- obfitość i łatwość pozyskiwania u niektórych gatunków zwierząt np. świń

- bardzo duża wydajność syntezy białka

- myszy- hormon wzrostu człowieka

  • Białko jaja

- doskonałe źródło rekombinowanych białek

- bardzo duże możliwości reprodukcyjne (kilkaset sztuk potomstwa rocznie)

- krótki odstęp międzypokoleniowy (ok. 7-8 miesięcy)

- niskie koszty hodowli drobiu

- problemy techniczne:

mikroiniekcja egzogennego DNA do zapłodnionych jaj

modyfikowanie pluripotentnych komórek blastomerowych

wektory retrowirusowi

- biologicznie aktywny, prawidłowo glikozylowany interferon 2b człowieka

- przygotowanie ekspresji białka C1(dziedziczny obrzęk naczynioruchowy)

  • Jedwabniki

- jedwabnik morwowy (Bombyx Mori) – naturalny producent jedwabiu dla przemysłu

włókienniczego

- kokon- potencjalne źródło dużych ilości zrekombinowanych białek

- krótki czas zwiększenia liczebności jedwabników

  • Mleko (naturalny bioreaktor, 2 gruczoły wytwarzają białka)

Porównanie ekspresji transgenów u różnych gatunków


organizm

Ciąża

(m-c)

Dojrzewanie

(m-c)

Ilość mleka na laktację (l)

Okres po mikroiniekcji do produkcji mleka(m-c)

Mysz

0,75

1

0,0015

3-6

Królik

1

5-6

1-1,5

7-8

Świnia

4

7-8

200-400

15-16

Owca

5

6-8

200-400

16-18

Koza

5

6-8

600-800

16-18

krowa

9

15

8000

30-33


Porównanie ekspresji w transgenicznych zwierzętach z innymi systemami:

- wyższy poziom produkcji niż w bakteriach, drożdżach, komórkach owadów i ssaków

- 2-10g rekombinowanych białek na 1 litr mleka, w hodowlach tkankowych 0,2-1g/l pożywki


Gruczoł mlekowy- cele

  • Dodanie wartości (wzrost poziomu kazein w produkcji serów)

  • Poprawa wartości odżywczych (humanizowane mleko)

  • Produkcja białek do leczenia lub zapobiegania chorobom człowieka

  • Synteza biomateriałów (kolagen, białka pajęczyny)


Zyski

  • Wysoki poziom rekombinowanych białek w mleku transgenicznych zwierząt

  • Produkcja na dużą skalę ważnych białek terapeutycznych

  • Możliwość zwiększenia skali i znacznego obniżęnia kosztów kapitału i ryzyka

  • Uzyskanie złożonych lub unikalnych cząsteczek, których nie można uzyskać wydajnie innymi metodami

  • Bezpieczne i odnawialne źródło produktu


Zalety

  • Uzyskanie prawidłowo zwiniętych i złożonych kompleksów białkowych w gruczole mlekowym

  • Możliwość zwiększenia skali produkcji poprzez zwiększenie liczby zwierząt

  • Proces łatwiejszy i tańszy od budowy i walidacji większych pomieszczeń dla potrzeb fermentacji biofarmaceutycznej lub kultur tkankowych ssaków

  • Naturalna wydajność biologiczna i dopuszczalna ekonomika produkcji

  • Gruczoł mlekowy/sutkowy jest idealny do produkcji rekombinowanych białek

  • Gęstość komórek 1000 razy większa od bioreaktorów kultur tkankowych ssaków

  • 10 lub więcej g rekombinowanego białka na litr na dzień

  • Stała synteza podczas laktacji, do 10mies na jedno zwierzę

  • Sezonowość kóz można zmienić poprzez odpowiednia opiekę i metody hodowli co umożliwia całoroczną produkcję mleka

Przepisy prawne

  • Ford and Drug Administration, FDA

  • Committee for Prorietary Medical Procedures, CPMP

  • International Conference on Harmonization of Technical Requurements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use

  • Produkcja , rozwój, licencjonowanie produktów biologicznych: terapia genowa, rekombinowane białka, przeciwciała monoklonalne, białka terapeutyczne uzyskiwane w transgenicznych zwierzętach


Lepiej jako suplement diety niż lek-wtedy mniej norm trzeba spełnić.


Przepisy Urzędu Kontroli Leków i Żywności (FDA) i Europejskiej Agencji Oceny Produktów Medycznych(European Agency for the Evaluation of Medical Products, EMEA)

  • Kontrola zdrowia zwierząt

  • Zatwierdzenie konstrukcji genowej

  • Uzyskanie transgenicznych założycieli

  • Metodyka oczyszczania rekombinowanego białka

  • Charakterystyka rekombinowanego białka

  • Stabilność transgenezy

  • Warunki hodowli zwierząt

  • Zwierzęta z obszarów wolnych od chorób pionowych


Przykłady białek

  • A Tryn III – rekombinowana antytrombina III człowieka; mleko kóz

  • 1 antytrypsyna człowieka

  • Interleukina-2

  • Tkankowy aktywator plazminogenu, TPA

  • Erytropoetyna

  • Czynnik wzrostu podobny do insuliny

  • Zewnątrzkomórkowa dysmutaza nadtlenkowa

  • Hormon wzrostu człowieka

  • -glukozydaza

  • Kalcytonina z łososia

  • Kosmówkowa gonadotropina konia

  • Czynnik  wzrostu nerwu

  • Białko C

  • Chymozyna

  • -1,3 fukozylotransferaza







64


Współpraca

Wczytywanie...